课题研究的主要内容

1、课题研究的主要内容：1 利用现代分离分析技术对八宝景天中有效抑菌成分进行分离，分析。2 对植物各浸膏进行抑菌实验，筛选活性抑菌物质。3 对提取物有效成分进行结构鉴定。4 最终筛选出具有较好抑菌活性物质，即抑菌剂。 筛菌一 抑菌成分的粗提取 取植物干粉50g，然后按照中药熬制方法(分别加水2000ml、1000ml和1000ml，熬3遍，每遍熬制到200300ml，3遍滤液合并加热浓缩至500ml)制成水剂，经多层纱布过滤后再经细菌滤器过滤除菌，然后放入冰箱冷藏备用。二 抑菌实验 （1）生长速率法 提取物对病原真菌菌丝生长抑制作用的测定采用生长速率法，设空白为对照。将提取物用无菌水配制成质量浓度

2、为0.5 g.mL-1 ，0.25 g.mL-1 ，0.2 g.mL-1 ，0.15 g.mL -1，0.125 g.mL-1 ，0.1 g.mL-1 ， 0.05 g.mL-1 ，0.03 g.mL-1 ，0.02 g.mL-1 ，0.01 g.mL-1 ，9个浓度梯度。在无菌条件下，将供试菌种用0.4cm 的打孔器打出一定数量的菌饼备用培养好的病原真菌平板用打孔器打成菌片，放入以平板中央，培养5d后以菌片为中心用打孔器打成菌片(主要为了菌龄一致)，待培养基溶化后，从高浓度到低浓度用吸管吸取1mL提取物，放入培养皿内，然后趁热倒入9mLPDA培养基于9cm 培养皿中制成薄厚均匀的平板，并设不

3、加提取液的为对照。用灭过菌的镊子小心将菌饼放置在含药培养基上，菌丝一面向下，每皿接1块，每一浓度设3皿，然后加盖并标记，置于23恒温光照培养箱中培养，待培养72h后取出培养皿（有些生长较快的病菌培养48h），用菌落计数器量菌落直径(十字交叉量取两次，用其平均数)。按下列公式计算抑制率： 菌落直径(cm)=两次直径平均数 - 0.4(菌饼的直径) 对照菌落直径处理菌落直径 抑制率 ×100% 对照菌落直径 （2）孢子萌发法 对病菌孢子萌发抑制作用的测定采用载玻片法。均用 PDA培养基按照常规方法培养产孢，每种菌置备3个载玻片，并设清水为对照。将提取物制剂与病菌孢子悬浮液混合，使提取物浓

4、度为0.1 g.mL-1 、0.02 g.mL-1 两个浓度梯度，经适当培养后镜检孢子萌发率，以下列公式计算抑制率： 萌发孢子数 孢子萌发率×100% 检查总孢子数 对照孢子萌发率-处理孢子萌发率 孢子萌发抑制率 ×100% 对照孢子萌发率 实验方案一 八宝景天提取物化学成分的分离1 提取过程 称取干燥粉碎的植物若干kg，过60目筛，用95%的乙醇浸泡2h，提取液经真空减压浓缩回收乙醇溶剂得到八宝景天提取浸膏，如此反复3次，最终得乙醇浸膏若干kg。取若干kg浸膏，用少量水分散，然后依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、水分别萃取3次，各萃取液经真空减压浓缩，回收溶剂，分别得

5、石油醚提取浸膏，氯仿提取浸膏、乙酸乙酯提取浸膏，正丁醇提取浸膏、水溶液提取浸膏。2 分离步骤 取石油醚醚浸膏g以160一200目硅胶拌样，自然晾干，研细。采用200300目硅胶湿法上柱，依次用石油醚、石油醚一乙酸乙酷(1:0一0:Iv/v)、乙酸乙酯、乙酸乙酯一甲醇 (1:O0:1v/v)进行梯度洗脱，每500ml为一流份，薄层色谱（TLC）跟踪检测，合并相同提取液，再反复经硅胶柱色谱然后配合紫外光谱仪、硫酸显色、等检测方法并通过重结晶纯化手段最终得化合物。 氯仿浸膏、乙酸乙酯浸膏、正丁醇浸膏中化合物的分离同上。二 抑菌实验1 抑菌成分的提取分离 同上。以上得到的馏分编号。2 供试菌株 番茄灰

6、霉病菌、番茄早疫病菌、黄瓜枯萎病菌、黄瓜炭疽病菌、黄瓜菌核病菌、黄瓜白粉病菌、黄瓜霜霉病菌、辣椒疫霉病菌、油菜菌核病菌、；引起瓜类灰霉病、疫病、白粉病、根腐病、枯萎病、菌核病、蔓枯病、苗期猝倒病、立枯病；引起茄果类蔬菜的灰霉病、菌核病、黄萎病、根腐病、枯萎病、绵腐病、绵疫病、褐纹病、细菌性溃疡病、青枯病、髓部坏死病、苗期猝倒病、立枯病等3 培养基（1）马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基)马铃薯(去皮) 200g 葡萄糖 20g 琼脂20g 水1000mL pH值 自然（2）马铃薯蔗糖琼脂培养基(PSA培养基)马铃薯(去皮) 200g 蔗糖 20g 琼脂20g 水1000mL pH值 自然 以

7、上两种培养基具体制作方法是：将200g马铃薯去皮，去芽眼，切成小条放入铝锅中，加入1000mL水，煮沸2030分钟左右至马铃薯软而不烂时，用68层纱布过滤，取滤汁于锅中，补水至1000mL，加入琼脂熔化，再加入糖搅拌均匀，趁热分装于试管中。4化合物抑菌活性测定 （1）生长速率法 提取物对病原真菌菌丝生长抑制作用的测定采用生长速率法，设空白为对照。将提取物用无菌水配制成质量浓度为0.5 g.mL-1 ，0.25 g.mL-1 ，0.2 g.mL-1 ，0.15 g.mL -1，0.125 g.mL-1 ，0.1 g.mL-1 ， 0.05 g.mL-1 ，0.03 g.mL-1 ，0.02 g.

8、mL-1 ，0.01 g.mL-1 ，9个浓度梯度。在无菌条件下，将供试菌种用0.4cm 的打孔器打出一定数量的菌饼备用培养好的病原真菌平板用打孔器打成菌片，放入以平板中央，培养5d后以菌片为中心用打孔器打成菌片(主要为了菌龄一致)，待培养基溶化后，从高浓度到低浓度用吸管吸取1mL提取物，放入培养皿内，然后趁热倒入9mLPDA培养基于9cm 培养皿中制成薄厚均匀的平板，并设不加提取液的为对照。用灭过菌的镊子小心将菌饼放置在含药培养基上，菌丝一面向下，每皿接1块，每一浓度设3皿，然后加盖并标记，置于23恒温光照培养箱中培养，待培养72h后取出培养皿（有些生长较快的病菌培养48h），用菌落计数器量

9、菌落直径(十字交叉量取两次，用其平均数)。按下列公式计算抑制率： 菌落直径(cm)=两次直径平均数 - 0.4(菌饼的直径) 对照菌落直径处理菌落直径 抑制率 ×100% 对照菌落直径 （2）孢子萌发法 对病菌孢子萌发抑制作用的测定采用载玻片法。均用 PDA培养基按照常规方法培养产孢，每种菌置备3个载玻片，并设清水为对照。将提取物制剂与病菌孢子悬浮液混合，使提取物浓度为0.1 g.mL-1 、0.02 g.mL-1 两个浓度梯度，经适当培养后镜检孢子萌发率，以下列公式计算抑制率： 萌发孢子数 孢子萌发率×100% 检查总孢子数 对照孢子萌发率-处理孢子萌发率 孢子萌发抑制率

10、 ×100% 对照孢子萌发率 对合并的各馏分分别进行活性测定，对活性较好的馏分进行2次硅胶柱层析及HPLC分离纯化，最终得到活性单体化合物。HPLC色谱条件为色谱柱：Hypersil C18柱(10m，20.0 mm×250 mm)，流动相：甲醇-水(体积比64)，检测波长240 nm，流速为6 mL/min。抑制细菌活性实验采用圆形纸片扩散法。分别刮取供试菌菌苔一环于5mL无菌水中，摇匀菌悬液(浓度约为106个/mL)，倒入熔化并冷却至4050的培养基中，摇匀后，迅速分装于培养皿(90mm)中，待凝固后备用。取已消毒过的双层圆形滤纸片(6mm)浸取药液(约20ul)，略干

11、后平贴于培养基平板上，同时用溶剂做空白对照。置恒温培养箱中培养(3637，18h一24h)后分别观察结果，测量抑菌圈。以上步骤均按无菌条件操作，每个处理设3个平行样，结果取平均值。抑制真菌活性实验采用菌丝生长速率法:(l)菌饼制备:取保存的真菌菌种，接种于孟加拉红培养基上，于30下培养3一4d至菌丝长满全皿。用直径为1.ocm的打孔器制成若干菌饼备用。(2)含药培养基平板制备:准确将lmL药液涂布PDA培养基上制成含药培养基平板，在对照上则涂布相同体积的溶剂。(3) 抑制实验:在培养好的供试菌平板上，用接种针挑取菌饼轻放于含药培养基平板中央(有菌丝的一面向下)，每培养皿放置1个菌饼。每处理重复

12、3一4次。28士2下培养一段时间后检查各处理菌落的直径，按以下公式计算不同处理对供试菌的菌丝生长抑制率。菌丝生长抑制率(%)=(对照菌落直径一处理菌落直径)/(对照菌落直径一菌饼直径 )X100%抑制细菌活性测定 96孔板微量稀释法：将供试样品以DMSO溶解再以水稀释至4000 mg/L的质量浓度，以此质量浓度进行2倍稀释，以无菌水做阴性对照。无菌培养液和2.5%DMSO溶液为空白对照，以硫酸链霉素作为阳性对照。微孔板震荡混合后，置于37培养箱内培养18 h后观察结果，肉汤没有浑浊的孔中的最低药液质量浓度为样品对供试细菌的最低抑菌质量浓度(MIC)，取没有混浊的孔中的肉汤，接种于未加药的培养基

13、平板上，37培养12 h后取出观察，没有细菌生长的最低药液质量浓度为样品对供试菌的最低杀菌质量浓度(MBC)。所有活性测定均重复3次。 单因素实验影响加杨叶中类胡萝卜素提取的因素较多，如:提取溶剂浓度、液料比、温度、时间等。首先，我们采用单因素实验考察各种因素对提取率的影响，单因素每次实验重复3次，计算重复实验结果的均值、标准差和方差，同时分析了单因素不同水平对实验结果的影响。(l)提取溶剂的选择类胡萝卜素是脂溶性色素，可溶于丙酮、石油醚、无水乙醇、乙酸乙醋等(何兰，2008)。考虑到石油醚具有价格经济，提取液色素干扰小等优点，本文采用石油醚为提取溶剂。(2)超声时间的选择在液料比为30:1，

14、超声功率200W，超声提取温度25，超声1次的条件下，不同超声时间对加杨叶中总类胡萝卜素得率的影响如图2一2所示。由图2一2可以看出，随着超声时间的延长，提取率逐渐增大，超过25min后，提取率有所下降。考虑到类胡萝卜素的不稳定因素，提取成本也会增加，提取过程应尽量在较短时间内完成，实验中超声时间选取25min。(3)不同超声功率对提取率的影响在25、液料比30:1、提取次数1、超声时间为25min的条件下，不同超声功率对提取结果的影响如图2一3。图2一3可以看出，超声功率在400w内，超声功率与总类胡萝卜素得率呈一定的正向关系，原因主要在于在超声场中，声波可以产生空穴效应，在剧烈的振动下，细

15、胞壁和细胞膜破碎，从而促进物质扩散，一般来说，超声强度与提取率成正比关系;当超声功率为500W时，得率则下降。原因是过高的超声功率会对类胡萝卜素分子产生一定的破坏作用(李洋等，2008)。故实验选择超声功率40ow。(4)不同液料比对提取率的影响在25、超声功率400W、超声时间25min、提取1次的条件下，不同液料比对提取得率的影响如图2一4所示。图2一4表明，加杨叶中总类胡萝卜素得率随着液料比的增高而提高，当液料比大于40:1时，得率基本稳定，主要是因为浸取过程中当包容与固体的溶液的溶质浓度和浸出液溶质浓度相等时，浸取达到平衡。因此实验中选择提取率较大时的液料比40:l。(5)不同温度对提

16、取率的影响在超声功率400W、超声时间25min、液料比40:1、提取次数1的条件下，不同温度对总类胡萝卜素得率的影响如图2一5所示。由图5可以看出，超声温度在25一55时，随着温度的升高，提取率明显增大，这主要是因为温度的提高能够增加化合物的溶解性和扩散速率，减小溶剂的勃度，使其可以容易的穿透组织，改善提取效率(张东明，2009);当温度大于55时提取率降低显著。这可能是由于类胡萝卜素长时间在较高温度下不稳定或结构发生变化的缘故(黄文等，2001)。实验中选择55进行提取。(6)不同提取次数对提取率的影响在55、超声功率 400w、超声时间25min、液料比40:1的条件下，分别采用不同超声

17、提取次数来提取加杨叶中总类胡萝卜素，结果如图2一6。由图2一6可知，得率随着超声提取次数的增加而增大，但样品中所含提取物的量是固定，因此得率的增加是有限的。另外提取次数的增加会使提取成本和提取时间增加，实验选择提取2次。2.3.4.3超声波提取正交试验分析(l)正交试验结果分析采用场L9(34)正交表，以总类胡萝卜素含量为考察指标，对超声波提取加杨叶中类胡萝卜素的工艺进行研究。正交实验及正交实验方差分析见表2一6。结果表明:以石油醚为提取溶剂，在提取2次的条件下，根据表2一6中极差分析结果可知各因素对类胡萝卜素得率的影响顺序为D>A>C>B，即超声温度>液料比>超

18、声功率>超声时间，其最佳水平组AZB3C3D3，即液料比40:1、超声时间3Omin、超声功率soow，超声温度55。同时表2一7中方差分析结果表明，超声温度对提取率的影响最为显著。(2)重复性实验取相同样品5份，以最佳工艺进行5次平行实验。结果如表2一8所示:RSD为2.82%，结果重现性好，该方法稳定可行。(3)精密度实验以最佳提取工艺制备提取液，分别取5份相同的提取液测定吸光度后计算总类胡萝卜素的含量。从表2一9可以看出该方法测定加杨叶中总类胡萝卜素含量，相对标准偏差较小，精密度较高，所得数据精确。2.4结论本研究通过单因素及正交试验，得出4因素对黄酮得率的影响从大到小依次是温度>液料比>乙醇浓度>提取时间。方差分析也表明:超声温度对总类胡萝卜素得率有显著影响。确定了超声波法以石油醚为提取溶剂提取加杨叶中总类胡萝卜素的最佳工艺参数:超声波功率为500W，液料比40:1，在55下提取2次，每次超声3伽min的条件下提取率最高为50.57m岁1009。其重复性试验RsD为1.03%，表明重现性良好;精密度试验RSD为0.34%，表明精密度良好。一 抑菌物质粗提取准确称取100 g的样品（叶，茎，花），于250 ml锥形瓶中，加入200 ml 95%的乙醇，室温下，超声提取45 min，连续提取3次，过滤粗提物