分子荧光法测定维生素B2的含量

1、【实验工程】分子荧光法定量测定维生素B2的含量【实验目的】1. 掌握标准曲线法定量分析维生素 B2的根本原理.2. 了解荧光分光光度计的根本原理、结构及性能,掌握其根本操作.【实验原理】荧光是光致发光.任何荧光物质都具有激发光谱和发射光谱,发射波长总是大丁激发波长.荧光激发光谱是通过测定荧光体的发光通量随波长变化而获得的 光谱,反映不同波长激发光引起荧光的相对效率.荧光发射光谱是当荧光物质在 固定的激发光源照射后所产生的分子荧光,是荧光强度对发射波长的关系曲线, 表示在所发射的荧光中各种波长相对强度.由丁各种不同的荧光物质有它们各自 特定的荧光发射波长,可用它来鉴定荧光物质.有些发荧光的物质其

2、荧光强度与 物质的浓度成正比,故可用荧光分光光度法测定其含量.维生素B2溶液在430440n怵光的照射下,发出绿色荧光,荧光峰在 535nm 附近.维生素B2在pFH67的溶液中荧光强度最大,而且其荧光强度与维生素B2 溶液浓度呈线性关系,因此可以用荧光光谱法测维生素B2的含量.维生素B2在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为另一物质一一光黄素,光黄素也是一 个能发荧光的物质,其荧光比维生素 B2的荧光强得多,故测维生素 B2的荧光时 溶液要限制在酸性范围内,且在避光条件下进行.在稀溶液中,荧光强度F与物质的浓度c有以下关系：F= 2.303 I0 £ bc当实验条件一定时,荧光强

3、度与荧光物质的浓度呈线性关系：F=Kc【仪器与试剂】1.仪器：荧光分光光度计型号：F2500 HITAH ; 1cm石英比色也；50mL容量瓶2.试剂：维生素B2标准溶液10.0 g/mL已加乙酸【实验内容与步骤】1. 系列标准溶液和待测溶液的配制取维生素 B2 10.0 g/mL标准溶液 1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL 分别置丁 50mL的容量瓶中,标定,摇匀.取2.00mL待测溶液丁 50mL的容量瓶中, 标定,摇匀.2. 激发光谱和荧光发射光谱的绘制用 3.00mLd的标准溶液设置入Em=520nr*发射波长,在250400范围内扫描,记录发射波长强

4、度和 激发波长的关系曲线,便得到激发光谱.记录最大激发波长设置入Ex为最大激发波长即371nm在400600nm范围内扫描,记录发射强 度与发射波长问的函数关系,便得到荧光发射光谱从荧光发射光谱上找出其最大 的发射波长入Emffi荧光强度.3. 标准溶液及样品的荧光测定将激发波长固定在371nm荧光发射波长为521nm测量上述系列标准溶液的 荧光发射强度,按浓度从从低到高测定.在同样条件下测定未知溶液的荧光强度,并由标准曲线确定未知试样中维生素B2的浓度.【实验数据】1. 激发波长入Ex=371nm 荧光发射波长入Em=521nm2. 标准溶液剂待测溶液的浓度和荧光强度记录维生素B2溶液浓度1

5、 g/mL0.20.40.60.81.0待测溶液相对荧光强度26.7051.7675.3598. 81121.050.38可得待测溶液的浓度为0.393 g/mL.1.以入Em=52的发射波长,溶液浓度为0.6头g/mL,在250400nmffi围扫描得到的荧光强度和激发波长的关系曲线3.设置激发波长为371nm溶液浓度为0.6从g/mL,在400600nm范围内扫描,所得发射强度与发射波长间的荧光发射光谱如下：3.以激发波长入Ex=371nm 荧光发射波长入Em=521nm测量系列标准溶液浓度, 以标准溶液的荧光发射强度为纵坐标,标准溶液浓度为横坐标,制作标准曲线如下:【结果分析与讨论】1.

6、 石英皿是四面透光的,拿的时候不能接触到四个透光面,只能拿上下角部,擦外壁残留液时由丁擦镜纸不吸水,故可先用吸水纸巾擦干,再用擦镜纸擦.2. 本次实验所得到的R值为0.99977 ,而理论R值为1,相关度很接近,说明准确 度比拟高,溶液配制比拟准确.3. 配制好的溶液应尽快测量,防止久置成分变化而影响结果.4. 干扰荧光分光分光度法的因素：溶剂：同一荧光物质在不同的溶剂中可能表现出不同的荧光性质.溶剂的极性 增强,对激发态会产生更大的稳定作用,结果使物质的荧光波长红移,荧光强 度增大.(2) 温度：升高温度会使非辐射跃迁概率增大,荧光效率降低.(3) PH:大多数含有酸性或碱性取代基团的芳香族化合物的荧光性质受PH的影响很大.(4) 溶液外表活性剂的存在,减少非辐射跃迁的概率,提升了荧光效率.(5) 溶液中溶解氧的存在,由丁氧分子的顺磁性质,使激发单重态分子向三重态的 体系问窜跃速率加大,因而会使荧光效率降低.【思考题】1、试解释荧光光度法较吸收光度法灵敏度高的原因？答：原因是由丁现代电子技术具有检测十分微弱光信号的水平,并且荧光强度与 激发光强度成正比,提升激发光强度也可以增大荧光强度,使测定的灵敏度提升； 而吸收光度法测定的是吸光度,不管是增大入射光强度,还是提升检测器的灵敏 度,都会使透射光信号与入射光信号以同样的比例增大,吸光度值不会改变,因 此灵敏度不能