反刍动物饲用酵母菌株的分离、鉴定及其生物学特性研究

1、反刍动物饲用酵母菌株的分离、鉴定及其生物学特性研究反刍动物饲喂酵母类产品能提高反刍动物对饲料干物质、纤维素、半纤维素、蛋白质等有机物和磷的消化率(Lei等，2001)，能提高泌乳性能和产肉性能(周淑芬等，2003)。随着生物技术、畜牧业和饲料工业的不断发展，酵母类产品的开发利用已成为饲料工业一个活跃领域。酿酒酵母菌可以活化肠黏膜内的相关淋巴组织，提高免疫识别能力传统的酵母菌分类,是以形态特征和生理生化特性、生态学特性等表型性状为基础的。但这些表型性状只反映了很有限的遗传信息。有些酵母菌不仅细胞形态可以改变,而且生理生化性状(如对某些糖类的发酵及同化能力) 也会发生变异。因此,只靠个别表型性状的

2、差异作为不同酵母菌种的鉴别依据有时是不准确的。为了弥补分类方法的不足,新的技术和方法不断地被引入酵母菌的分类研究中。特别是近年来,随着分子生物学的发展和各项新技术的广泛应用,促使酵母菌分类鉴定工作有了飞速发展。对酵母菌鉴定工作来说,已从经典的表型特征的鉴定深入到现代的遗传特性的鉴定,细胞化学组分的精确分析以及利用电子计算机进行数值分类等新的层次上13 。 本实验对分离到的酵母菌株在形态学、生理学鉴定的基础上进行了分子生物学的鉴定，并对其进行了初步的生物学特性研究。1 材料和方法1.1 材料（1）饲料来源 ×××奶牛场。（2） 培养基 GPY 液(固) 培养基、PD

3、A马铃薯培养基液(固)培养基、麦氏培养基（醋酸钠培养基、McCLary）、克氏培养基、高氏培养基。12 试验方法121 菌种的分离、纯化及保种增菌培养无菌称量饲料样品30g，放入盛150 ml增菌培养液并带有玻璃珠的三角瓶中，180rmin，28振荡培养过夜。133 细菌的分离纯化振荡摇匀增菌液后，经2层无菌纱布过滤，吸取lml菌液梯度稀释成1O_。、1O_。、1O 、1O 4个稀释度，各取01 ml涂布于YPD和麦芽汁平板上，置28 恒温培养4872 h后，挑选不同菌落特征的单菌落采用平板划线法纯化，重复操作至连续3次都为单一菌落、镜检没有发现杂菌时，编号并转接斜面以备保存和液体扩繁。122

4、 形态观察（1）分离酵母菌形态特征观察：将单克隆接种于麦芽汁固体培养基， 25培养3 d后观察。观察菌落的形状大小，厚薄，同心圈明显与否，辐射线多少，中央的凹凸平，表面光滑度、光泽度、有无痣点、针棘、粉状或有无褶皱等，颜色(灰白、黄白、灰褐、黄褐、黄、橙红)及其它特征。（2）细胞形态与培养特征：分离酵母细胞的显微镜观察摇匀纯培养菌液，取1 ml菌液滴加到计数板上。取一环菌液，卢哥氏碘液(沈萍，2000)染色涂片，用高倍显微镜观察细胞形状、大小、无性繁殖方式。（3）酵母子囊孢子的观察：将鉴定菌株接种于Mcclary 培养基上, 2528 培养35 d, 涂片在显微镜下观察麦氏(McCLary)培

5、养基(醋酸钠培养基) 葡萄糖0.1g, KCl 0.18g，酵母膏0.25g，醋酸钠0.82g, 琼脂l.5g，蒸馏水l00mL。溶解后分装试管，1l5湿热灭菌15min。（4） 酵母掷孢子的观察 掷孢子的形成和形态：有些酵母菌能射出掷孢子并在玻壁上形成镜像。摇匀菌液，用接种环取一环菌液在PDA 固体培养基上划S型曲线，25倒置培养37 d，观察落入培养皿盖子上的担孢子落象，取落象内的担孢子及菌落表面细胞，镜下观察。马铃薯培养基(PDA) 葡萄糖20 g，马铃薯200 g，水1000 ml，加2 琼脂即为固体培养基， pH 自然。马铃薯去皮，切成块煮沸30 min，然后用纱布过滤，再加葡萄糖和

6、琼脂，溶化后补足水至1000 ml，121灭菌30 min。（5）酵母菌菌丝体的观察： 摇匀菌液，用接种环取一环菌液在PDA培养基上划线数条，在线的中央放置1片无菌盖玻片，25培养5 d，镜检盖片下面菌落边部的菌丝。123 生理生化测试(1) 发酵糖类:将菌种分别接种于糖发酵管（放有倒置杜氏小管的试管）中,之后用液体石蜡封口,放于25 恒温箱培养,观察并记录结果。糖发酵基础培养基：尿素lg，(NH4)2S04 29，KH2P04 259，MgS047H20 lg，MgS04·7H20 O19，酵母膏459，溶于1L蒸馏水中，115"C灭菌30min。 (2) 同化碳源:采用

7、生长图谱法,培养基为无碳培养基,先在1 mL 无菌生理盐水中接入新培养之酵母菌少许制成悬液,将此悬液全部倒入经溶化并冷却到45 的20 mL 基础培养基中,倒入培养皿,使菌体在培养基中混合均匀,静置,凝固后在28 把培养皿倒置几个小时,使表面不致太湿。然后在培养皿底部标记碳源名称,分别用无菌不锈钢匙,按标记加糖少许,如果结果不明显可于次日再补加一次糖。观察结果时,与葡萄糖作对照,凡能同化者在所加碳源的周围会形成生长圈。同化碳源基础培养基：硫酸铵（NH42SO4）： 5.0g 磷酸二氢钾（KH2PO4）：  1.0g硫酸镁（MgSO4.7H2O）： 0.5g 酵母浸

8、膏：  0.2g 琼脂： 15.0g 蒸馏水： 1000ml将以上成分依次混入1000ml水中，高压121摄氏度，15分钟灭菌后备用。(3) 同化氮源:与同化碳源一样,仍采用生长图谱法,改用无氮培养基,当培养基表面凝固后,用无菌不锈钢匙加上硝酸钾,另外以硫酸铵作对照,观察分析。同化氮源基础培养基：葡萄糖209，酵母膏059，KH2P04 259，MgS047H2019，分别添加不同氮源，如KN03至29或盐酸乙胺至29，溶于1L蒸馏水中，115。C灭菌30min。(4) 在无维生素培养基上的生长:取一环菌种,接种于培养基上,28 培养,连续观察1 周并记录结果。无

9、维生素基础培养基：(NH4)2S04 29，MgS04·7H20 lg，CaCl2·2H20 O19，KH2P04 259，NaCI O19，葡萄糖209，溶于lL蒸馏水中，115。C灭菌30min。 (7) 产生类淀粉化合物:在含培养基的试管中,接入酵母, 经25 28 振荡培养l 周后, 加1 滴Lugols 碘液,凡在试管的液体培养基中出现蓝、紫色或绿色者为正反应,即能形成类淀粉;出现棕色则为肝糖反应,这会混淆结果。因此,应将培养物保存几小时或过夜,如有棕色则会消失,而蓝色仍会挥留。产淀粉类似物培养基：(NH4)2S04 lg，KH2P04 259，MgS04

10、3;7H20 lg，CaCl2·2H20 O19，NaCl O19，酵母膏O59，葡萄糖209，溶于1L蒸馏水中，115。C灭菌30min。(8) 产酯:酵母接种在含YM 或麦芽汁琼脂的培养皿上,2528 培养2428 h ,凭嗅觉判断是否产酯。麦芽汁培养基葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，麦芽汁粉3 g，酵母膏3 g，水1000 ml，pH 自然，若加入1520 g琼脂，即为固体培养基，121 灭菌15 rain。 (9) 尿素分解试验:将酵母接种在含液体培养基的试管中,25 培养5 d ,如果颜色变红,则为正反应,即能分解尿素。尿素酶实验培养基：19蛋白胨，19葡萄糖，59NaCl，

11、29KH2P04和00129酚红，溶于lL蒸馏水中，调pH值为68，再加入209琼脂，溶解后分装试管，115"C灭菌30min后做成斜面备用。 (10) 石蕊牛奶试验:加石蕊的酒精饱和溶液于5 mL 新鲜脱脂奶中,使达浅紫色,分装于小试管,用常压杀菌,每天1 次,每次1 h ,共3 d。接种酵母菌后,2528 培养及观察1 周。观察牛奶的颜色变化、产酸、酸凝、胨化、指示剂还原及产碱情况。另需作一个空白、一个加酸、一个加碱的作为对照。现时多用溴甲酚紫代替石蕊,即于100 mL 脱脂乳中加入1. 2 mL 的1. 6 %溴甲酚紫的乙醇溶液。凡能分解脂肪,在划线处会形成脂肪酸钙而呈现垩状区

12、域。石蕊牛乳培养基 脱脂奶粉 100.0g 石蕊 750.0g 酵母浸膏 5.0g葡萄糖 3.0g 蒸馏水 1000ml 混合上述物质，高压121摄氏度，15分钟灭菌后备用。(12)分解脂肪试验; (13) 明胶液化:酵母菌种直线插入含明胶的试管培养基中。17 培养721 d ,如出现液化层,测量其毫米数比较液化程度。酵母用明胶培养基：麦芽汁1000ML,加明胶120g,加温使其溶解，分装试管，115灭菌20min,凝固后备用。(14) 产酸：将酵母接种在含葡萄糖2碳酸钙琼脂培养基上,25 或28 培养10 d ,如果此酵母能产生足够的酸,就可使不透明的

13、培养基变成透明(正反应)的,如果不太透明则为负反应。酵母生酸培养基：葡萄糖5g,经灭菌的碳酸钙0.5g,酵母浸出液100ml,琼脂2g,常压灭菌。1.2.4. 分子生物学鉴定： 26S rDNA 的扩增、序列测定和系统发育分析(1)酵母基因组DNA提取(玻璃珠法)将供试菌株接入盛有30 mL YPD液体培养基的三角瓶中，28，200 rmin摇床培养1618h。取15 mL培养物，室温下在离心机上3000 r 离心3 min，吸出或倒掉上清。细胞用05 mL无菌水重悬，室温下3000 r离心30s，倒掉上清，滤纸吸干液体，在漩涡振荡器上快速振荡分散菌体沉淀。细胞用200 ul破菌缓冲液重悬，加

14、O3 g玻璃珠(约200 uL体积)及200 uL酚氯仿异戊醇，高速振荡3 min。加200 uLTE缓冲液，快速振荡，高速离心5 min，室温下将水相转移到一个干净的离心管中，加800 uL无水乙醇，颠倒混匀。室温下高速离心5 min，去上清，沉淀用200 uLTE缓冲液重悬。加15 uLRNA酶A(1 mgmL)，混合，37温育30 min。加l0uL乙酸铵(4molL)及800 uL无水乙醇，颠倒混匀，室温下高速离心10 min，弃上清，干燥沉淀，DNA用50uLTE缓冲液重悬。置于20冰箱内冷藏备用。(2)基因组DNA的电泳检测取8ul此上样液(3uL溴酚蓝、5 uL DNA溶液)在1

15、琼脂糖凝胶上100V，50mA电泳30 min，分离，溴化乙锭(EB)染色10 min，经凝胶成像系统检测DNA纯度及亮度。(3)PCR扩增目的片段PCR反应体系的组成(50uL体系)表23 PCR反应体系Table 23 The PCR reaction systemPCR反应条件正向引物NLl(5-GCA TAT CGG TAA GCG GAG GAA AAG-3)， 反向引物NL4(5'-GGT CCG TGT TTC AAGACG G-3)。PCR扩增程序：95预变性5min； (94变性lmin，53退火8min，72延伸lmin20s)x36个循环；72最后延伸10min。

16、PCR扩增操作步骤扩增用试剂及PCR管置于冰盒中，超净工作台上操作。将试剂按双蒸水、PCR缓冲液、dNTP、正向引物(NLl)、反向引物(NL4)、Taq酶的顺序依次加入PCR管中，用量如表所示，加入Taq酶后轻弹管底，将Taq酶弹起，漩涡混合器震荡片刻，混匀后加入2uL模板DNA。离心30s，检查管内无气泡，依次放入PCR仪中，按设定反应条件扩增。(4)PCR扩增产物的电泳检测取5 ul PCR扩增液+3uL溴酚蓝上样缓冲液混匀，于1的琼脂糖凝胶上点样，以8 uL DNA Marker(DL2000)为对照，在130V，60mA电泳40min，EB染色后经凝胶成像系统检测。剩余PCR反应产物

17、原液20保存，备用。(5)序列测定及系统发育分析对所测的酵母菌株26S rDNA D1D2序列图谱校正后，提交GenBank，并在GenBankEMBLDDBJ等国际核酸序列数据库中进行同源序列搜索(BLASTsearch)，以比较测试菌株与酵母菌种模式株对应序列的相似程度，并结合形态学及生理学特征分析对其做出鉴定。因为酵母已发表种中的大多数种的26S rDNAD1D2序列已经登录到EMBLDDBJGenBank中，因此，可以根据同源搜索的结果初步确定所做菌株的分类地位：供试菌株与其亲缘关系最近的菌株的相似性为100，可初步确定为同一种；供试菌株与亲缘关系最近的菌株的相似性在99100之间，它

18、们的关系结合形态学特征而定；实验菌株与其亲缘关系最近的菌种的相似性<99，可初步确定为准新种。菌株间的序列比较用Clustal-X软件完成。用NeighborJoining方法进行分子系统学分析【73】，并进行1000次bootstrap统计学检验，用TreeView软件显示系统树。根据KURTZMAN 等4的方法，用引物NL1（5'-GCATAT CAA TAA GCG GAGGAA AAG-3'）和NL4（5'-GGTCCG TGT TTC AAG ACG G-3'）PCR 扩增分离菌株26SrDNA 近5' 端的D1/D2 区域。PCR 反应

19、体系（25L）：10×PCR 缓冲液（含20mol/L 的Mg2+）2.5L，引物NL1 /NL4（10mol/L）各1L，模板DNA(约50ng/mL)1.8/ 2.8L， dNTP（10mol/L）0.5L,Taq 酶（5U/L）0.2L，双蒸水18/17L。PCR 扩增条件：95预变性5min，94变性40s， 55退火40s，72延伸30s，40 个循环后，72延伸10 min。所得PCR 产物送上海生工生物工程技术服务有限公司纯化后，用PE 公司BigDye 循环测序试剂盒在ABI 377型DNA 自动测序仪上进行直接双向测序，正反向测序引物分别为上述NL1 和NL4。构建

20、系统发育树用校正后的分离菌株的26S rDNA D1/D2 区域序列，在GenBank 核酸序列数据库中进行同源序列搜索（BLASTsearch），以比较分离菌株与已知酵母菌相应序列的相似程度。根据同源序列搜索结果，下载相关酵母菌种的D1/D2区域序列，与分离菌株的序列放在一起，用ClustalX1.8 软件8进行多序列匹配排列，通过Neighbor-Joining 分析方法9构建系统进化树，并进行1000 次bootstrap 统计学检验。1.3􀀁 酵母菌的生物学特性研究1.3.2 􀀁 酵母菌的耐酸性制备pH 2.0、3.0、3.8、4.5 的液体培养基( 麦芽汁培养基,分别接种酵母菌株, 于28 培养72h, 镜检计数。从表3 可以看出, 在耐酸性方面, 酵母菌适宜在弱酸性的环境中生长繁殖。酿酒生产的入池酒醅需要一定的酸度,但不可很高, 这与酿酒发酵中酵母的耐酸性有一定的关系。酵母细胞壁物质在酸解过程中比较稳定，活性成分不易被破坏，能够通过胃到达肠道而发挥作用。 1.3.3 􀀁 酵母菌的耐温性把