论分离方法对移植卵巢卵泡发育的影响

1、论分离方法对移植卵巢卵泡发育的影响摘要：目的评估机械法、酶解法和酶解 机械结合法等分离方法对小鼠移 植卵巢分离卵泡的发育及其生殖潜能的影响，建立更好的卵泡分离技术方案。方 法B6D2F1新生小鼠卵巢移植后分别用机械法、长时酶解法、短时酶解法或酶解 机械结合法分离卵巢组织中的腔前卵泡，分离回收卵泡在体外培养12 d时加入绒毛膜促性腺激素（hCG）处理26 h，收获卵丘复合体进行体外受精。结果机械法的卵泡回收量、卵泡培养残存率、排卵率均高于酶解法，短时酶解法的排卵 率高于长时酶解法；酶解 机械结合法的平均卵泡回收量、平均排卵数、卵母细 胞成熟率等多项指标均高于其他各组。结论酶解机械结合法是分离小鼠

2、卵泡 良好的技术方案。关键词：卵巢卵泡卵母细胞培养技术胚胎组织移植人工诱导胚胎卵巢原始卵泡发育成熟可为受精机制研究和医疗性克隆提供 充足的卵母细胞源。对异体移植发育到一定程度的卵巢进行生长卵泡分离是人工 诱导卵泡发育的关键步骤之一 L1 3,迄今已经发展出两种卵泡分离技术，包括酶解分离法和机械分离法。这两种方法各有其缺点，使每个卵巢的卵泡回收率和 成熟率均停留于较低水平。本研究探讨了酶解法、机械法和酶解 机械结合法等 分离方法对小鼠移植卵巢分离卵泡的发育及其生殖潜能的影响，以期建立更好的卵泡分离技术方案。1材料与方法动物C57BL/6（B6）雌鼠、DBA/2（D2）雄鼠购自上海斯莱克实验动物有

3、限责 任公司合格证：SCXK沪）约麹00&，以B6雌鼠和D2雄鼠交配繁殖B6D2F1（F1） 小鼠。小鼠饲养于恒温（25 C）动物房单笼独立通风系统I I型，苏州市冯 氏实验动物设备有限公司），光照14 h，黑暗10 h，自由饮水取食。试剂M HF卩巧閒2：怕0032），门開6）,胶原酶1（17100017），脱氧核糖核酸酶（DNasel，卅217 0及ITS（胰岛素 转铁蛋白 硒混合物）均为美国Gibco公司产品；rFSH（注射用重组人促卵泡激素，瑞士 Serono公司）;LH（黄体生成素，美国Sigma公司）;hCG（中国丽珠集团丽珠制药 厂）;FCS（胎牛血清），penicill

4、in/streptomycin（青霉素/链霉素）及KSOVI+AA（MK 106卩）均为美国Chemicon公司产品。卵巢移植B6雌鼠（810周龄）与D2雄鼠（10周龄）4 ：1合笼培育F1 代, 次日查到阴栓者记为d;以20 d为孕期，预产期前3 d每日早晚查看孕鼠是否生产；断颈处死新生12 h以内F1小鼠，取出双侧卵巢待移植。异戊巴比妥（15 mg/mL） 麻醉成年（810周）F1雌鼠（移植受体）。消毒小鼠背部，在肋脊角区做纵向切口 进入腹腔，切除双侧卵巢，然后在左侧肾被膜下植入新生小鼠卵巢 2枚，层层缝 合伤口。待受体鼠清醒后送回鼠舍。卵泡分离 新生小鼠卵巢移植14 d后，将受体鼠断颈处

5、死，从肾被膜下取 出移植的卵巢，卵巢移植物约 2 mm大小，表面可见丰富的重构血管，在体视镜 下可清晰观察到卵巢移植物中的卵泡。用1 mL注射器（320310，美国BD公司）的针尖将每枚卵巢均匀横切为2块，4块卵巢组织混合后随机分组进行分离。A组（单纯机械法）将卵巢组织块转移至卵泡分离操作液（a MEM IIEPES，10%FCS 100 lU/mL penicillin， 100 mg/mLstreptomycin ，不含胶原酶和DNA酶）中，在带有37 C恒温热盘（VIATS U55SZX2A，奥林巴斯） 的体视显微镜下，用精细尖镊（直5#, Tl 181,中国淮安特申医疗器械有限公 司）

6、剥离卵巢中的卵泡。每隔5 min,即将已剥离的完整卵泡转移至事先装有1 mL卵泡培养液（a，5%FCS IU/mL FSH IU/mL LH, 1%ITS）的 35 mm培养皿中。共分离4次，总时间约20 min。B组（长时酶解法）将卵巢组织块用1 mL注射器针尖均切为3小块，置于500 卩 L 卵泡酶解液（aIIEPES，3 mg/mL胶原酶 I，1 mg/mLDNaseI）中，在37 C、体积分数为的CO2培养箱中消化20 min，第20分钟时将其从培养箱 取出，用200卩L移液枪吹吸消化液30次。在体视显微镜下将游离出的结构完 整的卵泡转移至事先装有1 mL卵泡培养液的35 mm培养皿中

7、。C组（短时酶解法）将卵巢组织块用1 mL注射器针尖均切为3块，置于500 卩L卵泡酶解液中，在37 C、体积分数为的CO2培养箱中消化，每隔5 min即 从培养箱中将组织取出，用200卩L移液枪吹吸消化液30次，在体视显微镜下 观察是否有游离的卵泡，如有则将卵泡迅速转移至装有1 mL新鲜培养液的35 mm 培养皿中。共消化20 min。D组（结合法）将卵巢组织块用1 mL注射器针尖均切成3块，转移至5001 mL卵泡培养液的卩L卵泡酶解液中，在37 C、体积分数为的CO2培养箱中消化5 min。然后在 带有37 C恒温热盘的体视显微镜下，在卵泡酶解液中用精细尖镊分离卵泡。每 分离5 min，

8、即将已分离得到的完整的卵泡转移至事先装有 35 mm培养皿中。共分离 4次，20 min。双荧光染色 每组随机选取部分分离卵泡，放入 Calcein AM（4 mmol/L， Sigma, C1359）和卜血 i 山 urn H 伽oUi mr 1 （10 mmol/I.，Sigma, E1903）混合液中， 37 C、体积分数为的CO2培养箱中培养45 min;卵泡悬液置倒置荧光显微镜观 察，在蓝光的激发下，活的卵泡发绿色荧光，死的卵泡发红色荧光，分别计数死、活卵泡数。卵泡体外培养 各组分离所得卵泡分别进行体外培养 12 d。第0天，分离 得到的卵泡培养在加有1 mL培养液的35 mm培养皿

9、中；第1天，加入1 mL新鲜 培养液;此后每天半量换液；第12天全量换为卵泡成熟培养液 a 贱,5%FCS lU/mL FSH， lU/mL LH，1% ITS，lU/mL hCG）;第 13 天，在加入卵泡成熟培养 液后26 h收集排出的卵丘复合体（OGCs>体外受精每组的OGC分别行体外受精。卵母细胞受精培养4 h后从受精 滴中洗出，转移至预先平衡过的KSOM+A的小液滴中培养。观察卵母细胞的成熟 率（以含有第一极体的卵母细胞百分率代表）、受精率（以双原核卵母细胞占有第 一极体卵母细胞的百分率代表）。统计学处理采用SPSS软分析。4组的卵泡存活率、培养卵泡各阶段成熟 率、排卵率运用单

10、因素方差分析（one way ANOVA），各组均数以最小显著差法 （least sig nifica nt differe nee,LSD）进行两两比较和显著性检验；卵母细胞成熟率和受精率采用 X 2检验。2结果分离卵泡回收量 经过分离操作后，显微镜下可见大量腔前卵泡，大部分 卵泡呈圆或椭圆形，边界清楚，部分卵泡外周附有或多或少的卵巢间质组织，卵母细胞成圆形，位于卵泡中央，透明带清晰可见 （图1A）。体视镜下回收卵泡边 界清晰、光滑的卵泡，计数各组回收卵泡量（表1）。表1各组卵泡回收量比较双荧光染色结果 卵泡双荧光染色后，在蓝光的激发下，活细胞显示绿色 荧光，死亡细胞则呈红色荧光。将卵母细胞

11、呈绿色、卵泡细胞70%呈绿色者视卵泡体外培养结果 每组卵泡在相同条件下培养12 d，计数5、 泡残存率;在加入hCG26 h后，计数排卵率。各组各项指标的结果见表 组卵泡体外培养结果比较体外受精结果各组收获OGC分别受精，获能精子密度控制在为存活卵泡（图1B）。各组活卵泡的百分率见表2。表2各组卵泡存活率比较12 d的卵5X 1053。表3各niL 1。早期胚置于KSOM+A中培养，卵的密度为每20卩L含15个。成熟率及 受精率的计数结果见表4。D组成熟率高于其他3组，余3组之间差别无统计学 意义；受精率4个组之间无差别。表4各组体外成熟与受精结果比较 3讨论近年来，多种哺乳动物，如小鼠、兔、

12、猪及人的卵泡诱导发育技术体系都 获得了很大进展M 7。在这些体系中，大多倾向于将卵巢中的卵泡单独分离出 来后再进行培养。有报道表明，分离卵泡只有其基底膜未受损伤并带有少量间质细胞、未成熟圆形卵母细胞位于其中央时， 体外培养才能成功。迄今常用的卵泡 分离方法有两种，包括利用水解酶（如链霉蛋白酶、胶原蛋白酶和脱氧核糖核酸 酶）消化卵巢的结缔组织而获得游离卵泡的酶解法和用锐利器械剥离出卵泡的机 械法L6Z lOJo就目前的资料来看，两种方法各有优缺点。酶解法是细胞生物 学研究中分离各种组织、器官中细胞的常用方法，因其操作简便有效而受到普遍 应用。酶解法分离卵泡时，普遍采用胶原蛋白酶和脱氧核糖核酸酶组

13、合配制成分 离液。这种分离液利用酶消化卵巢间质组织中的胶原蛋白，使卵泡从卵巢组织释 放出来，故在限定时间里可望收获较多的游离卵泡。有报道表明，用酶解法分离 卵泡培养的卵母细胞可有更高成熟率和卵裂率的趋势 11 o但是，分离液长时间 浸泡卵巢组织时，显然可能导致卵泡基底膜受到损伤， 从而使卵泡在后续培养中 更易于退化，降低了卵泡培养的残存率，因此酶的作用浓度和时间是个关键的问 题。用机械法分离卵泡，如果操作手法得当，可能保持卵泡基底膜的完整，从 而在体外培养过程中更容易维持卵泡的立体结构，保障更高的培养残存率。 Carrell等和Park等的结果显示，用机械法分离的卵泡，其残存率存活率显著 高于

14、用酶解法分离者112的等还进一步利用机械法来源的小鼠卵泡培14。用机械法从育成熟卵母细胞并成功制备了 1讦ET小鼠。但是，也有报道表明，移植后卵巢 切片显示有些腔前卵泡的卵母细胞与其周围颗粒细胞的很薄弱致密的卵巢间质组织中分离卵泡时， 往往难于避免牵拉卵泡的力量过大，很容易破坏卵母细胞与颗粒细胞的连接，而卵母细胞和颗粒细胞的缝隙连接异常，会影响卵母细胞的发育并导致减数分裂阻断L1316o故机械法能否保障卵泡存活率在很大程度上依赖于操作技巧，同时在有限的分离操作时间里很难提高卵泡的回 收量。从目前的报道来看，单用机械法从每枚卵巢中得到的卵泡数量非常有限， 平均每个卵巢只有和个4,14 o本研究结

15、果表明，酶解法的卵泡回收量、分离后卵泡培养的残存率、排卵 率均低于机械法（表1, 3），但分离刚结束时的卵泡活率却高于机械法（表2） o此 结果与Demeestere等的报道不符，却与 Carrell等和Park等的报道相似 L1I 13jo说明酶解法在分离卵泡时对卵泡造成的直接损伤较少，但对卵泡的远 期存活不利。值得注意的是，本研究采用酶解法分离卵泡时，设置了 C组即短时酶解法，采用酶解过程中每隔5 min收获1次卵泡的改变法，而该组的排卵率显 著高于常规的20 min酶解处理组，证明减少酶的作用时间是有价值的。为了提高分离卵泡的回收量，同时又保障较高的培养残存率、排卵率和卵 泡的生殖潜能，

16、本研究建立了将酶解法和机械法相结合来分离新生小鼠卵巢移植 物中腔前卵泡的技术方案。在结合法（D组）中，将卵巢组织块先在含有胶原蛋白酶和脱氧核糖核酸酶的分离液中37 C消化5 min，随即采用与单纯机械法相同 的操作手法进行剥离，同时将剥离出的卵泡立即转移至不含酶的培养液中。此做法利用酶的消化作用使卵泡周围的结缔组织得到一定消化，卵巢组织变得比较松 散，从而减少机械剥离时对卵泡的牵拉损伤，同时又使游离出的卵泡及时离开分离液，减少了水解酶对卵泡的作用时间，比单纯酶解法或单纯机械法更有利于保 持卵泡的三维结构。实验结果表明，D组中分离后卵泡的存活率与单纯酶解法（B、 C组）无差别，但高于单纯机械法（

17、A组），而每块卵巢的卵泡回收量、平均排卵数、 卵母细胞成熟率多项指标均高于其他各组，说明结合法具有绝对优于两法单用的 趋势。同时，采用结合法从每个卵巢移植块获得个卵泡（相当于194卵泡/卵巢）其中达到排卵，显著高于国内外文献所报道的相应数据。值得注意的是，本研 究用来源于4种分离方法所培育的卵母细胞进行体外受精，其受精率在各组间并 无显著差异，说明分离技术只对卵泡在后续培养中的发育与成熟有影响，而对那些发育至成熟的卵母细胞的生殖潜能并无显著影响。实验结果提示，本研究建立的酶解机械结合法是一个良好的卵泡分离技术，对卵巢组织工程的技术进步具有实际应用价值。【参考文献】Pict on H M,Ham

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