新型血管生成抑制融合基因ENDOVGEI151对胃癌抑制作用的比较评判

1、新型血管生成抑制融合基因END0-VGEI151对胃癌抑制作用的比较评判【摘要】目的比较内皮细胞抑制素一血管内皮细胞生长抑制因子151（END0-VGEI151）融合基因与ENDO和VGEI151单基因及联合基因医治对胃癌的抑制作用，评判融合基因的医治价值。方式成立荷胃癌裸鼠模型，48只荷瘤裸鼠随机分成6组：PBS组、AdLacZ组、AdENDO-VGEI151组、AdENDO组、AdVGEI151组及AdENDO+AdVGEI151联合组，每组8只。接种后第5天起在瘤体内和瘤周注射滴度为2X109pfu/ml的相应重组腺病毒500U1,联合基因组用250H1AdEND0+250u1AdVGE

2、I151,隔Fl1次，共10次。末次注射24h后处死动物，测量种植瘤体积和瘤重、抑瘤率、肿瘤微血管密度（MVD）、肿瘤细胞凋亡指数（AI）、血管内皮细胞生长因子（VEGF165）表达指数；流式细胞仪（FCM）和电镜观看检测癌细胞凋亡情形。结果融合基因组、ENDO组、VGEH51组和联合基因组种植瘤体积别离为（土）mm3、（土）mm3、（土）mm3、（土）mm3；抑瘤率为%、%>%；MVD别离为（士）、（±）、（±）、（±）；AI别离为（±）%、（±）%、（±）%、（±）%；VEGF165表达指数为（±）%、（

3、±）%、（±）%、（±）%；FCM分析凋亡细胞比例别离为（土）、（土）、（±）%、（土）。融合基因与两单基因或联合基因组相较,组间抑瘤率、MVD,AI及VEGF165表达不同均有显著性（POo结论融和基因ENDO-VGEI151通过抑制血管内皮细胞增殖，下调癌细胞表达VEGF165,协同抑制肿瘤内新生血管形成，诱导癌细胞凋亡，其疗效明显优于单基因和联合基因医治,值得深切研究。【关键词】胃癌；基因医治；血管内皮细胞生长抑制因子151Comparativeevaluationofinhibitoryeffectsofendostatin-vascularen

4、dothelialgrowthinhibitorl51chimericgenetherapyongastriccarcinomaAbstractObjectiveTocomparetheinhibitoryeffectsofendostatin-vascularendothelialgrowthinhibitorl51(EXD0-VGEI151)chimericgeneongastriccarcinomawithendostatinorVGEI151genealoneandcombinationoftheendostatinandTherecombinantadenoviruscontaini

5、ngEND0-VGEI151chimericgene,ENDOgeneandVGEI151genewasnudemicewererandomlydividedinto6groupswhichweresubjectedtotheinjectionofPBS,AdLacZ,AdEND0-VGEI151,AdEXDO,AdVGEI151andAdENDO+AdVGEI151injectionwasadministered10timesatanintervalof1daysafterimplantation,tumorsizeandweight,inhibitionrate,intratumoralm

6、icrovesseldensity(WD),apoptoticindex(AI),andVEGF165expressionindexwereevaluatedrespectivelyafterthemiceweresacrificed.ApoptosisofcancercellswasanalyzedbyFCMandelectronmicroscopyComparedwithendostatinorVGEI151genealonetreatedgroupandcombinationtreatedgroup,growthofimplantedgastriccarcinomawassignific

7、antlyreducedinsizeinmicetreatedwithchimericgenewithaninhibitionrate%versus%,%and%,MVDwasdecreasedsignificantlyintheAdEND0-VGEI151treatedgroup(±)versus(土),(土)and(±);VEGF165expressionwasalsodecreasedL(i)%versus(±)%,(±)%and(±)%;whileapoptoticcellswasobviouslyincreasedinthechime

8、ricgenetreatedmice(±)%versus(±)%,(±)and(±)%.ThepercentageofapoptoticfreshcancercellswasalsoincreasedbyFCMexamination(土)%versus(土)%,(土)%and(土)%.Therewasasynergisticbenefitforthechimericgenetherapyofhavingstrongerinhibitoryeffectsthaneitherendostatin,VGEI151genealoneorcombinationgr

9、oupandthiswasstatisticalsignificance(P<.ConclusionAdEXD0-VGEI151mayhavemultipleeffectsleadingtoantiangiogenesisaction.Thefusioncombinetwopotentangiostaticgenestoincreasethesuppressionoftumorangiogenesis,whichmayduetocreateconformationalchangesthatenhancebindingtoreceptorsonendothelialcellsandprom

10、otestabilitywithintheprotein,operatingthroughdifferentmechanisms,deservesfurtherattention.Keywordsgastriccarcinoma；genetherapy；vascularendothelialgrowthinhibitorl51抗血管生成疗法作为肿瘤医治的新兴策略受到关注，但己完成的血管生成抑制药物的临床实验结果却不十分令人中意。尽管存在实验设计和病例选择不妥的问题，但血管生成抑制剂的活性不强和特异性不高的问题不容轻忽。深切揭露肿瘤血管生成与生理性血管生成的不同；寻觅更强力血管生成抑制药物将是抗

11、血管生成疗法的研究重点:1L通过基因工程方式对现有血管生成抑制剂加以改造，能够制造出活性更强、功能更全的药物分子或医治基因2。有研究显示END0-VGEH51融合基因能够强烈抑制内皮细胞增殖，诱导凋亡；并能抑制胃癌细胞表达促血管生成因子；具有显著抑制血管生成及肿瘤生长的活性35,本研究旨在明确融合基因是不是具有比单基因或联合基因更强的抑瘤活性。1资料与方式材料健康纯种SPF级46周龄Balb/c裸鼠购自第二军医大学实验动物中心，共48只，雌雄兼有，体重(20±3)g,在清洁级动物实验室饲养；胃癌SGC-7901细胞购自中国科学院细胞所。DMEM购自美国G1BCO公司；丙化碘锭(PI)

12、购自Sigma公司；VEGF165免疫组化试剂盒购自武汉博士德公司；鼠抗人vni因子相关抗原单克隆抗体购自DAKO公司；细胞凋亡检测试剂盒购自Poster公司；SP免疫组化超敏试剂盒购自福州迈新生物公司。重组腺病毒的制备AdEXD0-VGEI151和AdLacZ的制备同前4；设计引物从pBV220Endosatin中扩增ENDO基因，在5端引入HindHI酶切位点和IL3信号肽序列，3端引入BamHI酶切位点取得609bp的IL3/ENDO片段。引物1：5-GCAAGCTTGCCACCATGAGCCGCCTGCCCGTCCT-GCTCCTGCTCCAACTCCTGGTCCGCCCCGGACTC

13、-CAACACAGCCACCGCGAC-3；引物2：5-GCGGATCCCTACTTGGAGGCAGTCATGAAG-30从pUC18VGEI151扩增VGEI151片段在其5端引入HindHI酶切位点和IL3信号肽序列,3端引入BamHI酶切位点取得510bp的IL3/VGEI151片段。引物3：5-GCAAGCTTGCCACCATGAGCCGCCTGCCCGTCCT-GCTCCTGCTCCAACTCCTGGTCCGCCCCGGACTC-CAACCAGTTGTGAGAC-3；引物4：5-GCGGATCCCTATAGTMGAAGGCTCC-3oDNA自动测序证明序列正确。腺病毒载体pCA13用

14、HindlH和BamHI双酶切线性化,用Hindlll/BamHI将目的基因片段游离与线性化的PCA13连接，构建成PCA13ENDO和pCA13VGEI151o酶切鉴定连接和阅读框正确后，同源重组法包装出重组腺病毒AdENDO及AdVGEI151,挑选鉴定后，扩增纯化，TCID50法测定滴度。荷胃癌裸鼠模型成立、分组和医治扩增人胃癌SGC-7901细胞，收成细胞调整细胞浓度为IX107个细胞/ml；取5义106个细胞/注射于裸鼠颈部皮下。恒温、通风、无菌条件下饲养，接种5天后100%成瘤。随机编号用系统抽样法分为6组：PBS组、AdLacZ组、AdENDO-VGEI151组、AdENDO组、

15、AdVGEI151组及AdENDO+AdVGEI151联合组，每组8只。接种后第5天起在瘤体内和瘤周用100口1微量注射器注射滴度为2X109pfu/ml的相应重组腺病毒500U1,每次选取不同方向进针各注入100U1；联合基因组用250UiAdEND0+250ulAdVGEI151,隔天1次，并测肿瘤的最长径(a)和最短径(b),共10次。肿瘤标本的搜集和检测最末1次注射24h后，处死动物，解剖出瘤体，测肿瘤的最长径(a)和最短径(b),按公式V二Jiab2/6计算瘤体积，称重。瘤体经生理盐水漂洗干净后，沿注射针道切取肿瘤组织制备单细胞悬液，PI单染法流式细胞仪检测活体肿瘤细胞生长周期；余瘤

16、体一半用15%中性甲醛固定，常规病理切片，行苏木素-伊红染色、FVIII因子、VEGF165免疫组织化学染色及TUNEL法凋亡染色；另一半快速切分成lcm3大小，以4%多聚甲醛固定，4C冷臧，送电镜制片观看。微血管密度计数：200倍光镜视野下记数被抗VIII因子抗体染成棕黄色的血管数量，结果用3个视野下的血管数量的平均数表示；癌细胞凋亡指数和VEGF165表达指数：在400倍高倍视野下，随机选取5个癌区，计算阳性细胞在全数癌细胞中所占的比例，取均值表示。统计学方式数据以均数土标准差(x±s)表示，采纳t查验或X2查验。2结果重组腺病毒的制备目的基因PCR结果见图1。3种重组腺病毒载体

17、酶谱分析见图2o用TCID50法测定病毒滴度约为义1011TCID50/mlo包装出的3种重组腺病毒经PCR鉴定证明目的基因存在。1.1DNA/EocRI+HindIIImarker；的IL3/END0-1inker片段；的linker-VEGI151片段；的IL3/EXD0片段；的IL3/VEGI151片断；DNAMassTMLadder图1目的基因PCR扩增电泳图融合基因医治对裸鼠种植胃癌生长的阻碍融合基因医治初期能够使肿瘤体积缩小（第3次医治后平均体积从缩小为），医治4次后融合基因组和各对照组肿瘤体积随种植时刻延长都有所增加，但可明显发觉融合基因组肿瘤增幅明显小于两单基因组和联合基因组，

18、医治终止时各组肿瘤体积不同加倍明显（见图3）。别离计算各组抑瘤率（见表1）,结果显示AdEND0-VGEI151明显抑制肿瘤生长,AdLacZ阻碍轻微，说明疗效并非由于腺病毒载体所致，而是转染医治基因发挥作用。AdEND0-VGEI151组、AdENDO组、AdVGEI151组及AdENDO+AdVGEI151联合组的抑瘤成效均明显优于AdLacZ组；融合基因医治的成效又明显优于AdEXD0和AdVGEI151单基因组及联合基因组（PO,而AdLacZ组和PBS组之间不同无显著性（P）。1.入DNA/EcoRI+HindIIImarker；ENDO-VEGI151（1114bp,；END0（6

19、09bp,；VEGI151（510bp,图23种重组腺病毒载体HindIII+BamI双酶切鉴定图3肿瘤细胞在裸鼠体内生长曲线表1裸鼠种植瘤的体积和重量及抑瘤率（略）注：与AdLacZ组或PBS对照组比较，*P；与AdENDO组、AdVGEI151组或AdENDO+AdVGEI151联合组比较，融合基因医治对MVD、AI和VEGF165表达的阻碍与AdLacZ组和两单基因及联合基因组比较，融合基因组肿瘤组织MVD明显减少，凋亡细胞比例显著增加，VEGF165表达明显减少（见表2）,组间不同均有超级显著性（P）。表2裸鼠肿瘤组织MVD、AI和VEGF165表达情形注：与AdLacZ组或PBS对照

20、组比较，*P；与AdENDO组、AdVGEH51组或AdENDO+AdVGEI151联合组比较，融合基因医治对活体肿瘤细胞增殖周期的阻碍FCM检测显示融合基因组显现明显的凋亡峰，有的细胞显现凋亡（见图4）,与单基因组或联合基因组相较不同均具有超级显著性（PO;而GOG1期、G2M期及S期细胞比例各组间不同无显著性（P）o融合基因医治对肿瘤细胞超微结构的阻碍AdLacZ组和对照组细胞无异样发觉，在融合基因医治组肿瘤组织中观看到典型的细胞凋亡形态，且凋亡细胞数量明显多于单基因和联合基因组。3讨论大量的抗血管生成动物和临床实验结果证明联合应用不同机制的抗血管生成药物能够产生协同作用；从不同环节更强烈

21、抑制新生血管形成和肿瘤生长，是提高抗血管生成疗效的重要方式6,7。作为联合医治的替代和改良，融合基因医治研究最近几年也受到关注。所谓血管生成融合基因疗法即应用基因工程技术将不同机制的血管生成抑制基因融合产生活性更强、功能更全、稳固性更高的新型医治基因，关于增强疗效和简化医治进程都十分有利8,9。国内有研究报导EXD0-VGEI151融合基因具有强烈的抗血管生成活性,但其与单基因和联合基因疗效的比较研究未见报导。本研究发觉融合基因医治组肿瘤的生长速度明显减慢，瘤体体积和重量明显低于两单基因和联合基因医治组，在各时刻点不同均有显著性（PO；专门是在医治初期可使肿瘤体积缩小。从抑瘤率分析，依照Web

22、b分数乘积法计算AdENDO和AdVGEI151理论相加效应（fa）联合=1-1-（fa）AdENDO1-（fa）AdVGEI151为,联合组的抑瘤率为高于理论值，说明联合基因医治的确具有协同作用。ENDO和VGEI151有各自独特的作用途径，联合医治发挥协同作用属意料当中。但融合基因的抑瘤率为,高于联合基因的确切机制还有待进一步研究。目前推测可能由于：（1）融合蛋白可与内皮细胞表面的两种受体结合使其与内皮细胞的亲和力增加；（2）结构的改变使融合蛋白与其中任何一个受体更易结合；（3）融合后改变了其中一个蛋白的稳固性、活性或组织定位区使其活性增强；（4）融合蛋白封锁内皮细胞表面的肝素受体或整和素

23、受体，阻断促血管生成因子结合。总之，融合基因医治为抗血管生成疗法提供了新思路，值得深切研究。另外融合基因医治在初期可使肿瘤缩小提示，在肿瘤发生初期新生血管数量少、生成时相同步性高、发挥调控的血管生成因子有限是抗血管生成医治的最正确机会，应用联合或融合基因医治能够有效操纵肿瘤生长乃至使肿瘤消退；而进入增殖期后肿瘤内血管数量激增，而且异时性和调控因子复杂性大大增加使医治极为困难。因此,作为术后辅助医治预防复发转移是抗血管生成疗法过渡到临床应用的最正确选择。【参考文献】1FerraraN,Kerberasatherapeutic,2005,438:967-974.2TandleA,BlazerDG3rd,Libuttigenetherapyofcancer:recentTranslMed,2004,2:22-42.3李，方国恩，华积善，等.内皮细胞抑制素-血管内皮细胞生长抑制因子151融合基因医治胃癌的作用及其机制.中华实验外科杂志,2005,22:1186-1189.4李，方国恩，闻兆章，等.新型血管生成抑制内皮细胞抑制素-血管内皮细胞生长抑制因子151融合基因医治胃癌的实验研究.中华实验外科杂志,2005,22:230-234.5 PanX,WangY,ZhangM,etofendostatin-vascularendothelialg