肌动蛋白解聚因子在动物生殖和胚胎发育中的作用

1、347肌动蛋白解聚因子在动物生殖和3胚胎发育中的作用宇兴江刘华杰倪华(东北农业大学生命科学学院,哈尔滨150030)摘要肌动蛋白解聚因子家族Cofilin/ADF(AC蛋白家族)属于肌动蛋白结合蛋白,是微丝骨架的一个重要调节者。AC蛋白家族能够截断微丝,促进肌动蛋白单体的解离和循环以及微丝解聚,调控微丝骨架的重建,进而影响与微丝骨架相关的一些生理功能如细胞增殖、迁移、凋亡及胚胎发育等。本文将着重介绍AC蛋白家族在动物生殖诸如精子发生、卵巢发育、卵子发生、卵裂,以及胚胎发育等过程中的调节与功能。关键词肌动蛋白解聚因子家族;精子发生;卵子发生;中图分类号Q26肌动蛋白解聚因子家族Cofilin家族

2、)合蛋白,、迁移、。该家族由Bamburg等于1980年在鸡胚的脑组织中发现并提:Cofilin1的mRNA主要存在于心脏和睾丸中,而Cofilin2mRNA主要存在于大脑、肺、脾和睾丸中(Ono等.1994)。二者虽都在睾丸中表达,但在睾丸的支持细胞中Cofilin1的mRNA的丰度是Cofilin2的8.5倍(Guttman等.2004)。表达部位的差异说明AC蛋白家族中的成员可能具有组织特异性功能。Cofilin2主要在发育后期的分化完全的肌肉中表达,由此推测它在肌肉生理学或再生中可能具有重要作用(Obinata等.1997)。ADF在胚胎发育期间低水平表达,出生后,在富含被覆上皮的组织

3、例如子宫、胃和肠中上调。Cofilin1在胚胎干细胞中的表达是ADF的5倍(郭林林等.2005)。因此,表达方式的差异说明,在不同的生理过程中起作用的分子各不相同。二、AC蛋白的活性调节真核生物中,AC蛋白是肌动蛋白动力学的一个最重要的激发者,其N2末端的Ser23残基的磷酸化后,抑制了AC蛋白与肌动蛋白结合的活性,也抑制了促进肌动蛋白丝解聚的活性。Ser23残基的脱磷酸可以恢复AC蛋白的活性。细胞中存在一系列的分子通过调控AC蛋白的磷酸化和去磷酸化来调控细胞中的肌动蛋白骨架,进而调控细胞的功能。研究表明:在哺乳动物细胞中存在四种不同的3纯,经过二十多年的深入研究,该家族逐渐扩大,囊括了许多相

4、关蛋白,如无脊椎动物的蚕食蛋白,猪的ADF或destrin、Cofilin,棘阿米巴属的载肌动蛋白,果蝇属的twinstar或D2G,以及非洲蟾蜍属的XAC21和XAC22(郭林林等.2005)。本文将着重介绍AC蛋白家族在动物生殖过程和胚胎发育中的作用以及分子调控。一、AC蛋白家族成员哺乳动物中,AC蛋白家族包括ADF,非肌肉型的Cofilin(Cofilin1或n2cofilin)和肌肉型的Cofilin(Cofilin2或m2cofilin),分别由三个独立的基因编码(宋慧娟等.2006)。这三个基因显示了高度保守的基因组成,其编码区在氨基酸水平上大约有74%是相同的1,这就决定了它们的

5、生物化学特性既相似又不同。AC蛋白家族成员都能与肌动蛋白结合,具有促进微丝解聚的作用。它们都可以提高肌动蛋白单体的水平,并与纤维型肌动蛋白(F2肌动蛋白)以1:1的摩尔比结合。Cofilin1和Cofilin2在哺乳动物发育期的骨骼肌和心肌以及成熟的心肌中共表达。但在成熟的骨骼肌中,Cofilin2单独表达(KiyokoNa2kashima等.2005)。除此之外,Cofilin1与Cofilin2国家自然科学基金(30500361)和黑龙江省教育厅科学研究项目(11511040)资助课题通讯作者 1994-2007 China Academic Journal Electronic Publ

6、ishing House. All rights reserved. 348激酶可以磷酸化AC蛋白:包含LIM结构域的蛋白激酶1和2(LIMK1和LIMK2),睾丸特异性激酶1和2(TESK1和TESK2)。这四种酶对AC蛋白的磷酸化受RhoGTPases的调控。其中,LIMK1受小GTPaseRac的调节,而LIMK2可以被GTPasecdc423和Rho所调控。不管是小GTPaseRac还是GT2Pasecdc42和Rho都是通过启动Rho相关激酶(ROCK)和活化的p21激酶(PAK)间接作用于LIMK1或LIMK242肌丝负端的延伸。CAP表达的缺失导致肌丝循环的障碍,在决定细胞方向上

7、,细胞的极性与Cofilin作用的一致性也会受损。体外Cofilin对于F2肌动蛋白的聚合和解聚合的能力是pH依赖的。在pH7.3的碱性条件下,Cofilin可以快速解聚Cofilin2F2肌动蛋白。Cofilin2F2肌动蛋白复合体的临界浓度是mol),在pH8.2pH值依赖的,在pH6.5时较低(2mol)。然而,Cofilin的分割活性不时显著提高(7依赖pH值。Cofilin活性的这种pH值依赖效应在+生理上的重要意义在于:在膜的Na2H反向运输附近,肌动蛋白丝比较稳定在细胞内的pH。使用pH敏感的荧结果显示当细胞内的pH,当pH值。相比之对于pH的变化缺乏回应。三、AC蛋白与动物生殖

8、(一)AC蛋白与精子发生Guttman等(2004)利用免疫荧光和WesternBlotting等技术证实AC蛋白存在于睾丸的支持细胞中。有报道表明,AC蛋白也存在于精子发生过程的各级生精细胞中,并广泛定位于细胞质中。如果AC蛋白在生精细胞中过度积累,将加速精子的死亡(Takahashi等.2002)。这些结果表明AC蛋白在精子发生中具有重要的作用。在哺乳动物精子发生过程中,精子细胞的肌动蛋白骨架发生变化导致圆形的精子细胞形成精子。在此过程中,LIMK1和LIMK2可以通过磷酸化AC蛋白来调节肌动蛋白骨架的重组,进而影响哺乳动物的精子发生。尽管LIMK2缺乏的小鼠可育,但精子发生明显不正常,体

9、重、睾丸、附睾、前列腺和精囊等副性腺的重量只是正常小鼠的80%左右。在LIMK2缺乏的小鼠中,大部分的曲细精管中的生精细胞的发育是正常的,但有小部分曲细精管的直径减小,其中只有早期的精母细胞存在。在睾丸中,还发现许多的合胞体生殖细胞,这种细胞被认为是凋亡的前兆。使用实验性隐睾模型的实验也说明在LIMK2缺失的睾丸中,生殖细胞的分化能力严重受5,6损,组织学的异常增多,细胞的凋亡也加快。LIMK1缺乏的小鼠,其睾丸发育与精子发生没有发生异常。睾丸中的支持细胞是具有吞噬作用的细胞,它532,使LIMK1和LIMK2的苏氨酸残基磷酸化,调节LIMK1和LIMK2活性,使AC蛋白磷酸化。除此之外,RO

10、CK/LIMK/Cofilin信号通路还可以被B2Raf调节,使Cofilin磷酸化(Catrin等.2004)。AC蛋白的脱磷酸化过程依赖于AC蛋白的磷酸酶Slingshot(SSH),SSH在多种细胞中都可以使AC蛋白脱磷酸化而活化。在果蝇中,缺乏SSH基因将会使磷酸化的Cofilin/ADF和F2肌量大大提高。此外,SSH/ADF去磷酸化。人类的hSSH1/hSSH1LSSH(mSSH)的同括、mSSH2L和4mSSH3L。,hSSH1和hSSH2L的表达都可以显著降低磷酸化的Cofilin/ADF的水平并且抑制LIMK1或TESK1介导的肌动蛋白丝的装配。hSSH1和hSSH2L在调节

11、由于对Cofilin的解聚和活化所引起的肌动蛋白骨架的变化方面起着重要的作用。在体外,hSSH1和hSSH2L与F2肌动蛋白结合,在培养细胞中与肌动蛋白丝共定位。而hSSH3L并不与F2肌动蛋白结合,对磷酸化Cofilin的活化比hSSH1和hSSH2L的要弱得多。mSSH1L和mSSH2L可以与F2肌动蛋白结合,但是不能与球型肌动蛋白(G2肌动蛋白)结合。mSSH1L在神经系统外部和神经中广泛表达;mSSH3L在各种器官的上皮组织显著表达,而mSSH2L在许多非神经器官4的表达比神经中的水平低很多。磷脂酰肌醇242磷酸酯(PIP)和磷脂酰肌醇24,52二磷酸酯(PIP2)可以与Cofilin

12、的1042115氨基酸残基和N2末端区域结合,从而抑制肌动蛋白与Cofilin3的结合。Cofilin与G2肌动蛋白结合,形成异源二聚体,使Cofilin失去分割和解聚微丝的活性。有报道表明,环化酶相关蛋白(cyclase2associatedprotein,CAP)刺激Cofilin从Cofilin2G2肌动蛋白异源二聚体中释放,并帮助F2肌动蛋白从顶端解聚。CAP也可以通过提高ADP2actin向ATP2actin的交换来支持 1994-2007 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.

13、 349可以清除精子发生过程中凋亡的生殖细胞。这一功能依赖于黏附动力学的调节,支持细胞的这种黏附动力学是以肌动蛋白的重建为基础。目前研究表明,RhoB/ROCK/LIMK/Cofilin信号通路在调节支持细胞的黏附中具有重要作用。Rho效应蛋白如:Rho相关蛋白激酶(ROCK)、磷脂酰肌醇242磷酸酯252激酶(PIP25K)等与RhoGTPases相互作用形成一个精密的网络调节肌动蛋白的重建,从而影响支持细胞7的黏附,最后使精子质量降低。因此,理解Rho2familyGTPases和LIMK在精子发生过程中的功能将在理解精子发生过程中肌动蛋白骨架动力学方面扩展我们的视野。(二)AC蛋白与卵巢

14、发育和卵子发生研究表明:在果蝇中,AC蛋白可能通过调节果蝇卵巢中细胞的形态和运动性来参与果蝇卵巢的发育。twin2star(tsr)基因编码果蝇中的Cofilin/ADF。果蝇的卵巢由大约20个卵巢管组成,立的进行卵的发育。端也称为终丝,它由89,。终丝对于果蝇卵巢的发育是必需的,它是卵巢管分化的第一步,它的缺失将抑制卵巢管的发育。在tsr突变的果蝇卵巢中,不存在终丝结构将导致卵巢发育的失败。这种突变表型有温度敏感的特性,当tsr突变体处于25时,卵巢中的肌动蛋白丝与野生型相比大量增加,其中终丝细胞中的肌动蛋白丝增加最多,并且肌动蛋白丝分布异常。当tsr突变体处于18时,终丝发育正常,可见肌动

15、蛋白丝有小量增加。AC蛋白的表达量导致肌动蛋白丝量的变化,从而影响了终丝结构。由此可见,tsr的突变导致了AC蛋白表达量降低,使肌动蛋白丝不能解聚而大量积累,影响了终丝结构的形成,从而影响了卵巢的发育。在果蝇的卵子发生过程中,壁细胞(也称边缘细胞)的迁移是至关重要的。对tsr突变体中的壁细胞迁移进行分析。在18,tsr突变的成年雌蝇不育,但卵子发生相对正常。但在卵子发生的第10个阶段(果蝇的卵子发生分为14个阶段)有12%的卵泡出现壁细胞迁移受损。在25,tsr突变的成年雌蝇的壁细胞迁移异常缓慢,在卵子发生的第10个阶段及其以后各阶段壁细胞仍然处于滋养细胞中间。而在野生型成年雌蝇中的第9个阶段

16、壁细胞就已经发生了迁移。对卵子发生的第10个阶段的tsr突变体进行检测发现,有92%的突变体的壁细胞无法到8达滋养细胞/卵母细胞的边缘。除此之外,在突变体中一些卵泡呈现了“倾倒(dumping)”现象乳母细胞核(nurse2cellnuclei)进入了卵母细胞中,而在野生型中,乳母细胞核直到卵子发生结束都停留在滋养细胞中,卵子发生结束后它们作为滋养细胞的内含物被排出并存放在卵母细胞中。与此相反,在tsr突变体的第10或11阶段乳母细胞核在卵母细胞中就已经存在,黄色的卵母细胞颗粒在滋养细胞中也有发现。这些结果表明,Cofilin/ADF直接参与了卵子发生过程中的壁细胞迁移以及乳母细胞核的8“倾倒

17、”,最终影响了卵子的发生。AC蛋白在其它动物的卵巢发育和卵子发生过。(三)AC环。,AC蛋白集中在卵AC蛋白的特异,结果抑制了卵裂,表明AC蛋白对于卵裂是必需的。AC蛋白的调节物LIMK1和SSH在Hela细胞的胞质分裂期有不同的调节活性:LIMK1从分裂的前中期到中期含量较高,而SSH的活性在分裂的末期和胞质分裂期升高。二者含量和活性的增加直接影响了AC蛋白的含量,最后调节了肌动蛋白骨架,影响卵裂。Gohla等于2005年发现了一个新的AC蛋白的特异性磷酸酶2chronophin(CIN)。CIN在有丝分裂中调节AC蛋白的去磷酸化,还可以被不同形式的SSH活化(Huang等.2006)。在非

18、洲蟾蜍合子的分裂期间,分裂前期出现第一个AC蛋白去磷酸化峰可能依赖于CIN,因为CIN的活性出现早于SSH。SSH及CIN对AC蛋白的调节最终反应9在肌动蛋白的动力学上,决定卵裂是否成功。(四)AC蛋白与胚胎发育原肠胚的形成包括大量的不同类型细胞的协同运动,这与细胞肌动蛋白丝的动力学密切相关。在非洲蟾蜍的原肠胚时期,存在大量的磷酸化的AC蛋白,同时SSH的含量也提高。向非洲蟾蜍的胚胎中注射AC蛋白的mR2NA,导致AC蛋白的含量下降,造成细胞迁移受损,原肠胚运动发生缺陷;向非洲蟾蜍胚胎注射SSHmRNA,发现SSH异位表达,原肠胚发育停滞;而SSH的过表达也将抑制原肠胚的形成,因为过多的SSH

19、使AC蛋白的活化形式增加,扰乱了肌动蛋白丝的动力学抑制了细胞的迁移。这些结果表明,非洲蟾蜍的原肠胚的发育与细胞中AC蛋白的活性调10节有关。 1994-2007 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 350Cofilin1缺失的小鼠胚胎在原肠胚阶段(第9.5天),形态与野生型相差无几。这说明Cofilin1在哺乳动物的原肠胚阶段,对于广泛的形态建成运动可能不是必需的。Cofilin2在缺失胚胎的溶胞产物中几乎检测不到,而ADF比正常胚胎的表达量高34倍,这说明ADF也许对原肠胚的顺利形成

20、有补偿作用。但是ADF的过表达并不能完全补偿哺乳动物原肠胚发育之后由于Cofilin1缺失所造成的发育缺陷。在Cofilin1缺失的小鼠胚胎第9.5天后,将会产生明显的发育缺陷。第10.5天Cofilin1缺失胚胎的大小比正常的小很多,对184个胚胎进行的分析表明神经管闭合失败。在Cofilin1缺失胚胎中,神经板可以形成,但神经管沿体轴闭合失败,并且与野生型相比Cofilin1缺失胚胎的神经外胚层的增殖减少导致神经外胚层非常薄;而且在缺失胚胎中的分裂活跃的细胞经常在一个小区域内成簇存在,这是细胞分裂后出现的分散缺陷,所有Cofilin1,有缺口和体节失调,1亡。测到ADF表达。在胚胎发育第8

21、.5天,Cofilin1在神经嵴中表达量最高,在第9.5天,仍然在发育的神经系统和神经嵴细胞中高表达。神经嵴由一组可以快速移动的细胞组成,从神经嵴中迁移出来的细胞转移到胚胎的不同的部分,参与胚胎发育。因此,神经嵴对胚胎发育具有重要的作用。Cofilin1对于神经嵴细胞及轴旁中胚层的其他类型细胞的迁移是必需的。在Cofilin1缺失的胚胎中,神经嵴细胞也不能极化,分层和迁移受损,进而影响神经嵴衍生组织的发育。例如由于神经嵴细胞功能的缺陷导致颅间质明显的缺陷。除神经嵴细胞之外,也发现在鳃弓和头部区域的细胞迁移受损。此外,神经前体细胞增殖和扩增也需要Cofilin1的参与。这些结果说明,在神经嵴细胞

22、的分层和迁移过程中的细胞骨架动力学方面1Cofilin1起重要作用。综上所述,AC蛋白家族作为肌动蛋白结合蛋白,对肌动蛋白动力学起着调控作用,并通过RhoGTPase/ROCK/LIMK/cofilin/ADF信号通路重塑肌动蛋白骨架,从而影响与肌动蛋白骨架重组有关的真核生物的生殖诸如精子发生、卵巢发育、卵子发生、卵裂,以及胚胎发育等过程。对于AC蛋白家族的深入研究,将有助于从细胞骨架的调节角度阐明动物生殖过程的机理,同时为提高体外受精胚胎的妊娠率,提高克隆的成功率,以及为治疗由于配子发生和胚胎发育异常所引起的不孕症,提供了实验依据。参考文献1GurniakCB,PerlasE,WitkeW.

23、Theactindepolymerizingfactorn2cofilinisessentialforneuraltubemorphogenesisandneuralcrestcellmigration.DevBiol,2005,278:231241.2DesMaraisV,GhoshM,etal.Cofilintakesthelead.Cell26.ReosM,etal.Actinbind2profcytoskeletalmicrofilaments.2003,83:433473.OhtaY,KousakaK,Nagata2OhashiK,etal.Differentialactivitie

24、s,subcellulardistributionandtissueexpressionpat2ternsofthreemembersofSlingshotfamilyphosphatasesthatdephosphorylatecofilin.GenesCells,2003,8:811824.5KoshimizuU,SawadaK,TajimaY,etal.White2spottingmutationaffectstheregenerativedifferentiationoftesticulargermcells:Demonstrationbyexperimentalcryptorchidismanditssurgicalreversal.BiolReprod,1991,