保留残迹对前交叉韧带重建移植物愈合影响的组织学研究

1、    保留残迹对前交叉韧带重建移植物愈合影响的组织学研究保留残迹对前交叉韧带重建移植物愈合影响的组织学研究作者：刘佰川，高加智，孙 磊    作者单位：(解放军第88医院全军骨科中心，山东 泰安 271000)    【摘要】  目的观察保留残对迹前交叉韧带(anterior cruciate ligament，ACL)重建移植物愈合的影响，并探讨其原因。方法新西兰兔40只(封闭群，体重2.93.5 kg，平均3.2 kg)随机分为3组，每组10只。取其跟腱为移植物，切断双侧前交叉韧带，随机一

2、侧保留ACL残迹，对侧切除残迹，行前交叉韧带重建。分别于术后4、8、12周处死动物，取关节内重建ACL移植物标本10%多聚甲醛固定、10%EDTA脱钙、包埋、切片，HE染色及Masson、PAS特殊组织化学染色，检测成纤维细胞密度及观察组织学形态，数据采用SPSS 12.0软件进行统计分析。结果各时间段保留残迹组移植物HE染色组织切片成纤维细胞密度均高于切除残迹组，两组比较有显著统计学差异(P<0.05)，两处理组8周时细胞密度高于4、12周，不同时间段比较有统计学差异(P<0.05)。各时间段保留残迹组移植物的组织学表现均优于切除残迹组。结论保留残迹ACL重建有利于新生细胞长入替

3、代移植物，促进移植物组织结构成熟。    【关键词】  膝关节; 前交叉韧带; 残迹; 重建; 愈合    A histological stduy on the effects of preserving the remnant on incorporation of tendon autograft in anterior cruciate ligamen reconstructionLIU Baichuan, GAO Jiazhi, SUN Lei. Orthopaedic Center of PLA, The 88th Hos

4、pital of PLA, Tai 'an 271000,ChinaAbstract：ObjectiveTo observe the effects of preserving the remnant on healing of ACL autograft in anterior cruciate ligament (ACL) reconstruction, and discuss the reasons. MethodForty closed colony New Zealand rabbits with the average weight of 3.2 kg were divid

5、ed into 3 groups at random, each group had 10 rabbits. The anterior cruciate ligament of the rabbit was cut off in both knees, the remnant of original ACL was preserved on one side and removed on the opposite side at random, then single bundle anterior cruciate ligament reconstruction was conducted

6、with autogeneous Achilles tendon graft. Animals were executed and the intraarticlar graft specimens were taken at 4, 8, 12, weeks postoperatively respectively. The specimens were fixed with 10 % paraformaldehyde, decalcified with 10% EDTA. The specimens were taken and embeded, sliced, and then strai

7、ned with HE and Masson, PAS special histochemistry to observe fibroblast density and histopathological situation, Statistical Analysis were carried out using SPSS12.0 software.ResultIn each time section, the fibroblast density of ACL grafts tissue section with HE dyeing in preservingremnant group wa

8、s higher than that in removingremnant group, there was significant difference between two groups (P<0.05). The density of 8 week time section was higher than 4 week time section and 12 week time section. There was significant difference among different time sections in each treatment group (P<

9、0.05), the histological appearance of ACL grafts of preservingremnant group was batter than removingremnant group. ConclusionThe ACL reconstruction by preservingremnant is beneficial to the newborn cells/ growing in of the ACL grafts and beneficial to the histological maturity of the ACL grafts.Key

10、words：knee; anterior cruciate ligament; remnant; reconstruction; healing  前交叉韧带损伤是膝关节外伤中常见的损伤之一，应用自体半腱肌和股薄肌肌腱进行前交叉切带重建的手术方法己逐渐成熟，其供区病损小、对伸膝装置无干扰、可取得与采用髌韧带重建类似的膝关节稳定效果，已成为国内外治疗ACL损伤的主流重建方法1，重建术后移植物的良好愈合是手术取得成功的关键。近年来许多研究发现，原ACL残迹(remnant of ACL)对重建后移植物的再血管化以及细胞增殖有促进作用，并可促进神经再生，因此，保留残迹的手术方法可能更有利于

11、移植物的愈合。目前已有相关的临床研究2,8,9，但动物实验还未见报道。本研究在动物实验对保留残迹ACL重建与切除残迹重建ACL进行组织学对比研究，以探讨保留残迹ACL重建的手术方法对ACL移植物愈合的影响。1 材料与方法1.1 实验动物分组与处理新西兰兔(封闭群)，数量40只，体重2.6±0.2 kg，雌、雄各20只，用随机数字表进行随机化分组，按饲养时间4、8周、12周分为3组，每组10只。动物麻醉后仰卧手术台上，屈膝90° (图1a)，取跟部后正中切口，切取跟腱外侧2/3作为移植腱。将跟腱修整至长约5 cm，直径为2 mm，两端编织缝合，保留尾线作为牵引线(图1b)，置

12、于生理盐水中备用。行关节外侧纵切口，将髌骨牵向内侧至脱位，暴露关节腔。切断ACL，随机一侧保留上、下端残迹各约2 mm长，另一侧完全切除上下端残迹。沿原ACL方向，在定位器导引下在胫骨止点处向下、内用2 mm钻头钻取胫骨隧道，同样方法，钻取股骨隧道，在牵引线引导下，将制备好的移植物植入骨隧道内，移植物两端拉出骨隧道外部分反折，并以牵引线拉紧缝合于隧道外口软组织上(图2)，逐层间断缝合切口。术后不予外固定，分笼饲养， 自由活动。1.2 标本采集与处理于术后4、8、12周分别处死动物，打开膝关节腔，生理盐水冲洗关节。切取关节内重建的前交叉韧带的移植物标本，10%多聚甲醛固定、10%EDTA脱钙，常

13、规脱水、透明、浸腊、包埋。制备5 的移植物纵向切片，分别行HE染色及Masson、PAS特殊组织化学染色，显微镜下观察，记录观察结果。1.3 组织形态计量与数据处理HE染色切片在IPP(ImagePro Plus System)通用医学图像分析系统(泰山医学院生命科学研究所提供)下随机取5个高倍视野(每高倍视野面积约0.5 mm2)进行成纤维细胞核计数，取平均值，得出每高倍视野成纤维细胞密度。各组数据用±s表示，使用SPSS 12.0统计软件进行时间段内方差分析、总体数据2×3析因分析。2.1 显微形态观察结果4周时，保留残迹组见较多新生细胞自外周侵入移植物，胶原纤维排列紊

14、乱，PAS着色淡;切除残迹组新生细胞侵入较少，胶原纤维排列更加紊乱，PAS着色淡。8周时，保留残迹组移植物可见大量新生细胞，主要为成纤维细胞，胶原纤维排列仍紊乱，PAS着色有明显增强(图3a);切除残迹组移植物可见大量新生细胞，但数量较保留残迹组少，胶原纤维排列紊乱，PAS着色较保留残迹组淡(图3b)。12周时，保留残迹组移植物内细胞数有明显减少(图4a)，形状多为长梭形，胶原纤维排列整齐(图5a)，PAS着色较好;切除残迹组移植物内细胞数较少(图4b)，胶原纤维排列比较整齐，但较保留残迹组稍差(图5b)，PAS着色较保留残迹组淡。2.2 移植物成纤维细胞密度 各组HE染色切片每高倍视野成纤维

15、细胞计数(细胞密度)结果及SPSS 12.0统计软件2×3析因分析结果见表1。可见各时间段保留残迹组移植物成纤维细胞密度均高于切除残迹组，两组比较均有显著统计学差异(P<0.05)。2处理组在术后4周时成纤维细胞密度较低，8周时达到高峰最高，12周时细胞密度降低(图6)，8周时细胞密度明显高于4、12周，2处理组不同时间段比较有统计学差异(P<0.05)。时间与手术方法间存在交互效应(P<0.05)。表1 移植物成纤维细胞密度注(1)#P>0.05, P<0.05, P<0.05; (2)2处理组4、8、12周比较P<0.05。3 讨 论前交

16、叉韧带重建后自体肌腱移植物的愈合是一个复杂的过程，多数研究者着重于ACL重建移植物骨隧道内组织愈合过程即腱-骨愈合过程。近年来的研究普遍认为：骨隧道的内愈合首先形成一圈富含血管的纤维结缔组织带(界面组织)填充在腱与骨之间3，4，随后来源于隧道骨组织的成纤维细胞逐渐长入，形成连接，继而形成类似直接韧带-骨止点的结构5。关节内移植腱大致要经历缺血坏死、血管重建、细胞增殖和塑型成熟4个阶段，最终成为类似韧带的结构。这一过程主要由关节内组织细胞“爬行替代”重建ACL的移植腱。王永健等6应用半腱肌腱重建前交叉韧带术后观察关节腔内重建移植物组织学形态时发现：移植手术后第2周，可见关节腔内的肌腱组织坏死，表

17、现为细胞核溶解，新生的组织尚未长入替代;术后1个月，见到有大量新生的细胞从移植物外周向中心长入，新生细胞呈梭形，较正常半腱肌腱和前交叉切带细胞的体积大;术后第2个月，关节腔中的移植物富含细胞，呈类圆形，胶原纤维排列无序;术后第4个月，移植物中细胞数目接近正常前交叉切带，细胞呈长梭形，胶原纤维纵向排列比较整齐;术后第6个月，移植物细胞数目和形态已经类似正常前交叉切带，胶原纤维纵向排列整齐有序，并具有很好的弹性;术后第9个月，移植物组织学形态进一步成熟，细胞及胶原纤维排列更加整齐有序;术后第12个月，细胞形态更加类似正常前交叉切带的短杆状并在局部出现成串状排列。在本实验中通过对每高倍视野成纤维细胞

18、数量(细胞密度)的检测来评价移植物的愈合程度，发现术后8周时成纤维细胞密度最高，明显高于4、12周，这与王永健的研究结果一致，说明移植腱关节内愈合过程中，移植物细胞数量均经历先增多后下降过程。图1 兔ACL重建手术 图1a 手术体位 图1b 移植物制备，肌腱修整后直径约2 mm，两端编织缝合，留尾线约8 cm 图2 兔ACL重建手术 图1a 保留残迹ACL重建，黑箭头所指为原ACL残迹;图1b 切除残迹ACL重建，黑箭头所指为重建后ACL 图3 8周PAS染色ACL移植物组织学观察100× 图1a 保留残迹组，PAS着色较强 图1b 切除残迹组，PAS着色较保留残迹组弱 图4 术后1

19、2周HE染色ACL移植物成纤维细胞密度观察100× 图1a 保留残迹 图1b 切除残迹组。保留残迹组细胞密度较切除残迹组高。图5 12周Masson染色ACL移植物组织学观察100× 图1a 保留残迹组，移植物内细胞数有明显减少，形状多为长梭形，胶原纤维排列整齐。图1b 切除残迹组，胶原纤维排列比较整齐，但程度较保留残迹组稍差 图6 术后移植物内细胞密度变化。术后4周细胞密度较低，8周达高峰，12周细胞密度降低。各时间段保留残迹组细胞密度均高于切除残迹组。在临床中重建ACL手术时往往将原ACL的残迹完全清除，以更好地暴露韧带止点、定位骨隧道内口。近年来国内外许多学者逐渐认识

20、到原ACL残迹对ACL移植物的愈合有重要的促进作用。Georgoulis等7研究的认为原ACL残迹中的本体感受器有可能是ACL移植物神经再分布的重要来源。Lee等8认为残迹有利于移植物再血管化以及细胞增殖，因此主张最大限度保留ACL残迹。孙磊等9认为残迹有利于移植物血供和神经支配的重新获得，并可以封闭骨隧道关节内口，阻止关节滑液自隧道口进入骨隧道内，从而有利于移植物隧道内的愈合。本研究在IPP图像分析系统辅助下检测移植物的成纤维细胞密度，得出数据经过统计学分析表明，术后4、8、12周保留残迹组的细胞密度均显著高于切除残迹组，提示ACL被切断后，残迹滑膜有血供，残迹内的组织细胞仍未丧失活力，可以

21、向移植物内长入替代，从而大大促进移植物的细胞增生。伴随新生细胞长入移植腱并增生，产生胶原和蛋白多糖等基质，并对移植腱原有基质替代改建。Goradia10发现ACL重建后移植物内胶原纤维排列随时间增加由紊乱逐渐沿韧带纵轴整齐排列。Goertzen等11采用HE、PAS染色等方法观察犬前交叉韧带重建后组织学变化，认为新生细胞长入能促进重建后移植物的生物力学及组织学特性向韧带转化。Masson染色可以较好地显示胶原纤维的排列情况，PAS染色可以显示移植物基质内蛋白多糖的分布情况12。本研究发现术后412周保留残迹组与切除残迹组ACL移植物的胶原排列与蛋白多糖表达也有差别，保留残迹组相对于同时间组内切

22、除残迹组胶原排列更为规整，且PAS染色着色较深。这进一步说明保留残迹有利于细胞长入移植腱，增生并产生新的细胞基质，促进胶原纤维的改建与重排列，改善移植物的生物力学特性，使其更加接近正常韧带。综上所述，笔者认为，ACL残迹并非无用组织，它可以促进ACL重建移植物的愈合，ACL重建手术应尽量保留ACL残迹。【参考文献】1 Lawhorn KW, Howell SM. Principles for using hamstring tendons for anterior cruciate ligament reconstructionJ. Clin Sports Med, 2007,4: 567-5

23、85.2 Lee BI, Min KD, Choi HS, et al. Arthroscopic anterior cruciate ligament reconstruction with the tibialremnant preserving technique using a hamstring graftJ. Arthroscopy,2006, 3: 340 -347.3 Petersen W, Laprell H. Insertion of autologous tendon grafts to the bone: a histological and immunohistoch

24、emical study of hamstring and patellar tendon graftsJ. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc, 2000,1: 26- 31.4 陈百成，栾 广，张展翅，等.自体骨膜包裹肌腱对腱骨愈合的影响J.中华骨科杂志，2006, 2: 118-122.5 ESI Zhang CL， Fan HB, Xu H, et al. Histological comparison of fate of ligamentous insertion after reconstruction of anterior cruciate

25、 ligament: autograft vs allograftJ. Chin J Traumatol, 2006,2: 72-76.6 王永健，敖英芳.自体半腱肌腱移植重建前交叉韧带移植物组织学变化的实验研究J.中国运动医学杂志, 2004,6. 609-612.7 Georgoulis AD, Pappa L, Moebius U, et al. The presence of proprioceptive mechanoreceptors in the remnants of the ruptured ACL as a possible source of reinnervation of the ACL autografiJ. Knee Surg Sports T