单细胞凝胶电泳法检测苯作业工人淋巴细胞DNA损伤

1、论著单细胞凝胶电泳法检测苯作业工人淋巴细胞DNA 损伤邢彩虹 李桂兰 李玉英 曲青山 常平 穆瑞东 王援相 尹松年(本文图1见封四摘要! 目的 用碱性单细胞凝胶电泳技术检测苯作业工人外周血淋巴细胞DNA 损伤, 研究苯的遗传毒性。方法 采用碱性单细胞凝胶电泳技术。将接苯工人按累积浓度、历史平均浓度和测定当时8h 时间加权平均浓度(8h TWA 分组。观察指标包括DNA 断裂分级(将DNA 断裂损伤细胞按其损伤程度分级 及DNA 彗星尾长(彗头末端到彗尾的长度 。结果 接苯工人DNA 断裂程度及DNA 彗星尾长lg(尾长+1 两个参数, 接苯组按累积浓度、历史平均浓度和8hTWA 浓度计算, 均

2、明显高于对照组, 差异有显著性(P <0. 01 , 并有明显的剂量-反应关系。结论 彗星试验能够快速、敏感地检测苯引起的人类淋巴细胞DNA 损伤, 提示对于检测环境致癌物和致突变物可能是一有用工具。关键词! 苯; 单细胞凝胶电泳(彗星试验 ; DNA 损伤Study of DNA dam age among workers exposed to benzene by alkaline single cell gel electrophoresis detection XING Caihong *, LI Guilan, LI Yuying, et al. *Institute o f

3、Occu pationa l Medicine, Chinese Academy of Preventive Medicine, Beijin g 100050, ChinaAbstract ! Objective To detect DNA damage in peripheral lymphocytes of workers exposed to benzene by alka li ne single cell gel electrophoresis and to study the genetic toxicity of benzene. Methods Alkali ne singl

4、e cell gel elec trophoresis(Comet assay was used.T he workers were divided into different group s by levels of accumulative exposure, his torical average and the eight hour time weigh ted average(8h TWA . The grade of DNA breakage and tail length of Comet assay were used to measure DNA damage. Resul

5、ts The grade of DNA breakage, the tail lengthlg(tail+1 and levels of accu mulative exposure, historical average and 8h TWA were significantly higher in lymphocytes of exposed workers, compared to matched controls(P <0. 01 . The dose response relationship was significant in the above three benzene

6、 con centrations. Conclusion Comet assay could sensitively and more conveniently detect DNA damage induced by benzene in human lymphocytes. It may be a useful tool for hu man bi omonitoring, particularly for the analysis of environ mental muta gens and carcinogens.Key w ords ! Benzene; Single cell g

7、el electrophoresis(SC GE, comet assay ; DNA damage以往大量实验和现场研究资料表明, 苯是一典型致突变剂, 可以引起动物和人体染色体的广泛损伤。彗星试验作为一种检测DNA 损伤的技术, 已成为检测苯引起DNA 损伤及苯的遗传毒性的有效方法。Plappert 等1证明单细胞凝胶电泳试验(SCGE可在染苯小鼠的肝脏和血细胞中检测DNA 的损伤。在苯暴露工人外周血淋巴细胞中也多次检测出了DNA 损伤2, 3。为研究苯引起DNA 损伤的剂量-反应关系, 我们用彗星试验检测了苯作业工人外周血淋巴细胞的DNA 损伤。对象与方法1. 研究对象:接苯工人组46人

8、, 分别选自制鞋作者单位:100050北京, 中国预防医学科学院劳动卫生与职业病研究所(邢彩虹、李桂兰、常平、尹松年 ; 天津市劳动卫生职业病研究所(李玉英、穆瑞东、王援相 ; 纽约大学医学中心环境医学研究所(曲厂及体育用品厂; 对照组工人26人, 选自粮库管理人员。工人接苯水平按以下3种方法计算:(1 将从事接苯工作各年接苯平均浓度接苯工龄的总和作为工人一生接苯总量, 即累积浓度。共分3组:<150、150300、>300mg m -3 a -1; (2 收集工人从事接苯工作以来历史定点测定浓度水平, 以工种为单位计算历史接苯平均浓度。共分2组:<16. 5, #16. 5

9、mg/m 3; (3 现接苯水平(8h TW A 用美国3M 公司个体采样器采样分析, 共分3组:<16. 5、16. 540、>40mg/m 3。2. 彗星试验检测方法:单细胞凝胶电泳参照Singh 等4方法略加改进后进行, 主要有以下步骤:(1 分离细胞:取静脉血10ml, 肝素抗凝、离心, 分离出白细胞, 用淋巴细胞分离液分离出淋巴细胞, 用PBS 调整细胞浓度为106107个/ml 。(2 制片:在磨毛玻片两端(一端做平行对照 各铺200 l 正常熔,后揭去盖玻片, 取30 l 细胞悬液与45 l 低熔点琼脂糖(LMP A 混匀后铺于第一层琼脂上, 加上盖玻片, 4冷凝10

10、min 5。(3 裂解:揭去盖玻片, 将胶板轻轻放入预冷的(用前加入体积分数为1%的Tri ton X 100细胞 裂解液中, 裂解至少1h 。(4 电泳:将胶板放入新配制的电泳缓冲液中, 静置20min, 使DNA 双链解螺旋, 然后在25V 、300m A 条件下电泳20min 。(5 中和及染色:以0. 4mol/LTris 中和后, 用碘化丙啶染色。(6 彗星图像分析:荧光显微镜(400倍 下观察, 每片计数50个细胞。选用DNA 断裂分级及DNA 彗星尾长两种观察指标。DNA 断裂分级按彗星尾部长度占总长的比例判断:(图1 0级:<5%; 1级:5%; 2级20%; 3级:40

11、%95%; 彗星尾长为彗头末端到彗尾的长度。以50200 mol/L H 2O 2室温(12 培养正常人淋巴细胞1h, 作为阳性对照。3. 统计学分析方法:DNA 断裂分级比较, 采用 2检验及线性趋势检验; 彗星尾长比较, 采用秩和检验; 相关与回归分析; 将尾长取对数lg(尾长+1 接近正态分布后, 用方差分析。结 果1. 方法可靠性探讨:阳性对照物H 2O 2(50200 mol/L证明可引起人淋巴细胞DNA 彗星尾长显著改变, 并呈剂量-反应关系。2. 接苯组与对照组研究对象的年龄、性别、吸烟分布, 差异均无显著性(P >0. 05 。3. DNA 断裂分级和彗星尾长两参数表示D

12、NA 损伤(表1表3 , 接苯组明显高于对照组, 差异有显著性(P <0. 01 。4. DNA 断裂分级比较:按累积浓度(表1 、历史接苯平均浓度(表2 以及8h TW A 浓度(表3 分组的各浓度组(以下简称3种浓度组 均明显高于对照组, 差异有显著性(P <0. 01 , 不同接苯浓度组之间两两比较, 差异均有显著性(P <0. 01 ; 并存在剂量-反应关系(线性趋势检验P <0. 01 。5. 彗星尾长比较:按历史接苯平均浓度(表2 以及8h TWA 浓度(表3 分组的低浓度组彗星尾长均明显高于对照组, 差异有显著性(P <0. 05 , 其他各浓度组与

13、对照组差异无显著性(P >0. 05 。表1 不同累积浓度的接苯工人DNA 断裂分级及其%彗星&尾长组别(mg m -3 a -1 人数 细胞数 D NA 断裂分级(细胞数 0123细胞损伤率(% 算术均数 x s 几何均数 Gg苯工人组462300 139510. 61 13. 46 <150227100 733 5816514433*#8. 218. 02 0. 83( 0. 3415030013650 383 3711711341*#8. 577. 550. 85(0. 35 >30011550279598912349*#17. 832

14、3. 170. 99(0. 52对照组261300 1164 268129101. 972. 860. 370. 28P <0. 01( 检验 ; 各浓度组间比较, P <0. 01; 几何均数取自x =lg(x +1 (x 为尾长几何数值, x 为尾长算术数值 ; 彗星尾长算术均数与对照组比较, P <0. 05(秩和检验 ; 彗星尾长几何均数与对照组比较, (P <0. 05(秩和检验表2 不同历史浓度的接苯工人DNA 断裂分级及其%彗星&尾长组别(mg/m3 人数 细胞数 D NA 断裂分级(细胞数 0123细胞损伤率(% 算术均数 x s 几何均数 Gg

15、苯工人组462300 1395 10. 61 13. 46 <16. 5341700 1087 102 28123036*#8. 027. 79 0. 83( 0. 32#16. 512600308529015049*#17. 953. 441. 00(0. 52对照组261300 1164 268129101. 972. 860. 370. 28P <0. 01( 检验 ; 各浓度组间比较, P <0. 01; 几何均数取自x =lg(x +1 (x 为尾长几何数值, x 为尾长算术数值 ; 彗星尾长算术均数与对照组比较, P <0. 05(

16、秩和检验 ; 彗星尾长几何均数与对照组比较, (P <0. 05(秩和检验表3 不同8h TWA 浓度的接苯工人DNA 断裂分级及其%彗星&尾长组别(mg/m3 人数 细胞数 D NA 断裂分级(细胞数 0123细胞损伤率(% 算术均数 x s几何均数 Gg苯工人组462300 1395 10. 6113. 46<16. 5231150 829 671668828*#5. 655. 49 0. 72( 0. 2916. 54015750 423 5412614744*#10. 158. 750. 91(0. 37 >4084001433379

17、14564*#25. 7423. 981. 27(0. 40对照组261300 1164 268129101. 972. 860. 370. 28值 , P <0. 05( ; , (0. 05(秩和检验将尾长取对数lg(尾长+1 后, 3种浓度组的各浓度组尾长均明显高于对照组, 差异有显著性(P <0. 05 。除按8h TW A 浓度分组的低浓度组和中浓度组与高浓度组间差异有显著性(P <0. 05 外, 其他各浓度组间两两比较差异均无显著性(P >0. 05 , 但可看到在3种浓度组中随浓度增加尾长均有增加趋势。作回归和相关分析, 在散点图上未发现3种浓度下彗星尾

18、长分布有明显直线或曲线趋势, 尾长与累积浓度、历史接苯平均浓度、8h TW A 浓度间无明显相关关系。讨 论彗星试验在苯的体内遗传毒性研究中, 与微核实验、姊妹染色单体交换、染色体畸变相比同样敏感, 且具有简便、快速等优点。本试验中改进了传统的三层凝胶方法, 只铺二层, 使操作更简单, 镜下观察细胞核形态更清晰。也有人建立了带槽磨毛载玻片加盖玻片进行单层灌胶的方法6, 操作更为方便。本试验中, 无论是按工人一生接苯累积浓度、历史平均接苯浓度还是按8h TWA 浓度分析, 接苯工人DNA 单链断裂程度随接苯浓度的增加而增加, 并呈明显的剂量-反应关系。虽然在散点图上3种浓度下的彗星尾长分布均无明

19、显的直线或曲线趋势, 但就分组而言, 各浓度组尾长及取对数后的尾长均随浓度增加而增加, 且取对数后的尾长均明显高于对照组, 提示, 彗星尾长可以作为分析DNA 损伤的指标应用于群体分析。另外, 各浓度组间尾长两两比较差异无显著性可能是因为样本例数较少所致。有文献报道, 接苯组DNA 损伤明显高于对照组2, 7, 但未进一步证明苯暴露所引起的DNA 损伤的剂量-反应关系。也有报道, 高浓度接苯组(879. 0、376. 0mg/m 3和低浓度接苯组(172. 0mg/m3 DNA 损伤率与对照组差异无显著性3。我们的试验显示, 这种剂量-反应关系可能由于随着苯浓度增高, DNA 快速修复功能不能

20、与越来越多的损伤平衡, 使DNA 损伤加重所致。由于苯引起DNA 损伤是一个长期的过程, 虽然累积浓度与彗星尾长的相关性(r 2=0. 05 较低, 但按累积浓度分析DNA 断裂分级及彗星尾长结果差异均有显著性(P <0. 01 , 因此, 按累积浓度计算的工人总接苯量分析苯引起的DNA 损伤应更有价值。苯代谢物的遗传毒性可能是由于细胞色素P4502E1(cytochrome P4502E1, C YP 2E1 和髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO 将苯代谢为相关的毒性代谢CYP 2E1的催化作用被激活而引起骨髓毒性, 用选择性CYP 2E1丙烯乙二醇抑制剂预处理后,

21、可降低受试物的DNA 损伤率8。该试验与甲苯可以减少血液和骨髓细胞中苯的毒性报告一致9, 甲苯可能是抑制了CYP 2E1的代谢作用从而减少苯的代谢作用。但也有报道, 苯与甲苯混合暴露的工人外周血淋巴细胞DNA 损伤明显增加7, 说明甲苯的损伤作用不可低估, 甲苯的遗传毒性机制还有待进一步研究。在体外试验中, 苯代谢物苯醌、氢醌和苯三酚可以引起人淋巴细胞DNA 单链断裂和碱性不稳定损伤, 在低剂量范围内(<1 g/ml 尾长随浓度增加而增加, 当浓度进一步增高时, 尾长的增高趋势将趋向稳定, 这可能是导致自由基形成的苯内源性代谢活化作用在某一阶段达到饱和所致2。苯及其代谢物不象电离辐射、氧

22、化剂那样直接诱导DNA 损伤, 而是与DNA 共价结合形成加合物10, 在核酸内切酶的作用下进行切除修复, 增加DNA 的不稳定性, 导致基因突变和染色体畸变11。DNA 损伤与肿瘤发生有一定的关系, 由于SC GE 对低水平的DNA 损伤极其敏感, 因此, SCGE 可用于人类遗传损伤生物监测, 特别是作为职业有害因素对健康影响的早期监测指标有更好的应用前景。参 考 文 献1Plappert U, Barthel E, Seidel HJ, et al. Reduction of benzene toxicity by toluene. Environ Mol Mut, 1994a, 24:

23、283 292.2Andreoli C, Leopardi P, Crebelli R. Detec tion of DNA damage in humanlymphocytes by al kali ne single cell gel electrophoresis af ter exposure to benzene of benzene metabolites. Mut Res, 1997, 377:95 104.3袁野, 邬堂春, 陈胜, 等. 苯作业工人淋巴细胞DN A 损伤的研究.工业卫生与职业病, 1996, 22:80 82.4Si ngh NP, M ccoy MT, Tice RR, et al. A s imple technique for quantitati onof low levels of DNA damage in indi vidual cells. Exp Cell Res, 1988, 175:184 191.5Vis vardis EE, Tas siou AM , Pi peraki s SM, et al. Study of D NA da mage in