高速逆流色谱简介与应用

1、高速逆流色谱高速逆流色谱 1 1 2高速逆流色谱简介高速逆流色谱简介高速逆流色谱的应用高速逆流色谱的应用一、概述一、概述 高速逆流色谱（高速逆流色谱（HSCCCHSCCC）是一种连续高效的）是一种连续高效的液液- -液分配色谱分离技术液分配色谱分离技术。该技术不需要。该技术不需要固体支撑固体支撑体体，主要根据物质在，主要根据物质在两相中分配系数的不同对物两相中分配系数的不同对物质进行分离质进行分离，相对其他常用色谱（如柱色谱、高，相对其他常用色谱（如柱色谱、高效液相色谱等）来说，特点是效液相色谱等）来说，特点是无不可逆吸附无不可逆吸附和和回回收收率高率高，特别适合于，特别适合于天然活性成分天然

2、活性成分的分离。的分离。 HSCCC HSCCC技术最早是由美国国立卫生院技术最早是由美国国立卫生院Ito博博士士研制应用，我国对研制应用，我国对HSCCCHSCCC技术应用较早，技术应用较早，HSCCCHSCCC技术发展十分迅速，在过去技术发展十分迅速，在过去2030年中，年中，出现了一系列新型的分离技术，积累了大量的出现了一系列新型的分离技术，积累了大量的科研成果。科研成果。二二、HSCCC色谱色谱工作原理工作原理 HSCCC HSCCC色谱包括色谱包括储液罐储液罐、泵泵、螺旋管分离螺旋管分离柱柱、检测器检测器、色谱工作站色谱工作站或或数据采集软件数据采集软件或或记记录仪录仪以及以及馏分收

3、集器馏分收集器等部分。等部分。 选择溶剂体系选择溶剂体系平衡平衡选择固定相选择固定相充满螺旋管柱充满螺旋管柱高速旋转螺旋管高速旋转螺旋管泵入泵入流动相流动相流动相流出，注入待分离的样品流动相流出，注入待分离的样品收集馏分收集馏分HSCCC的工作流程的工作流程http:/ 如下图所示，螺旋柱中注满差不多相等体积的两相溶剂（见右侧试管），在螺旋柱的匀速转动下两相溶剂受到“阿基米德螺旋力”的作用，竞争性地朝首端移动。不久，两相在螺旋管地首端建立一种流体动力平衡，按一定比例共存，而这种情况发生在每一圈螺旋柱内。并且任何一相的超量都会被推向螺旋管的尾端一侧。固定相的保留固定相的保留利用螺旋管的方向性和同

4、步行星式运动产生的二维利用螺旋管的方向性和同步行星式运动产生的二维 离心力场形成的离心力场形成的单向性流体动力学平衡单向性流体动力学平衡（HDES）从而实现流动相高速移动时固定相的保留从而实现流动相高速移动时固定相的保留以以1000转转/ /分的速率分的速率进行旋转，在二维力进行旋转，在二维力场的作用下分离管柱场的作用下分离管柱内混合和传递的频率内混合和传递的频率可达到可达到1717次次/S/S，从而，从而实现高效的分离实现高效的分离混合区：混合区：在靠近离心轴在靠近离心轴心大约有四分之一的区心大约有四分之一的区域，两相的激烈混合域，两相的激烈混合静置区：静置区：两相溶剂分成两相溶剂分成两层，

5、重相在外部，轻两层，重相在外部，轻相在内部相在内部分分离离效效果果溶剂系统溶剂系统固定相固定相流动相流动相洗脱方式、流动相的流速洗脱方式、流动相的流速仪器的旋转方向和转速仪器的旋转方向和转速样品浓度和进样方式样品浓度和进样方式柱温等柱温等检测器检测器紫外紫外- -可见光检测器可见光检测器蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器质谱检测器等质谱检测器等http:/ 1 溶剂体系的种类溶剂体系的种类弱极性溶剂体系弱极性溶剂体系中等极性溶剂体系中等极性溶剂体系强极性溶剂体系强极性溶剂体系两相两相由由正己烷和水正己烷和水组成，可用组成，可用甲醇、乙醇、醋酸甲醇、乙醇、醋酸乙酯乙酯等来调节溶剂系统的极性。等来调

6、节溶剂系统的极性。典型的溶剂体系有典型的溶剂体系有：正己烷正己烷- -醋酸乙酯醋酸乙酯- -乙醇乙醇- -水水 正己烷正己烷- -醋酸乙酯醋酸乙酯- -甲醇甲醇- -水水中等极性溶剂体系的两相由中等极性溶剂体系的两相由氯仿氯仿和和水水组成，可以加入组成，可以加入甲醇、乙醇、醋酸乙酯甲醇、乙醇、醋酸乙酯等来调节溶剂系统的极性。等来调节溶剂系统的极性。适合于适合于黄酮类、蒽醌类、香豆素黄酮类、蒽醌类、香豆素和一些极性较大的和一些极性较大的木木脂素和萜类脂素和萜类的分离。的分离。典型的溶剂体系是典型的溶剂体系是氯仿氯仿- -甲醇甲醇- -水水（4 4：3 3：2 2）强极性溶剂体系的强极性溶剂体系的

7、两相两相基本物质是基本物质是正丁醇和水正丁醇和水，可以，可以加入加入甲醇、乙醇、醋酸乙酯甲醇、乙醇、醋酸乙酯等溶剂来调节溶剂系统的等溶剂来调节溶剂系统的极性，也可以在氯仿水体系中调节极性，也可以在氯仿水体系中调节pHpH值值来增大极性来增大极性, ,或或在异丁基甲醚水体系中加入在异丁基甲醚水体系中加入适量的酸和碱适量的酸和碱. .适合于极性适合于极性很强的生物碱类化合物的分离。很强的生物碱类化合物的分离。典型的溶剂体系典型的溶剂体系: :氯仿氯仿- -甲醇甲醇-HCl-HCl异丁基甲醚异丁基甲醚- -水水（有机相加三乙胺，水相加盐酸）（有机相加三乙胺，水相加盐酸）2 2 溶剂体系选择的步骤溶剂

8、体系选择的步骤（1 1）预测要分离物质的极性，粗选一个溶剂体系）预测要分离物质的极性，粗选一个溶剂体系；（2 2）取少量样品于上下相）取少量样品于上下相各各2 2毫升毫升的溶剂体系中，用的溶剂体系中，用TLCTLC进行检验，可加入进行检验，可加入甲醇、乙醇、醋酸乙酯甲醇、乙醇、醋酸乙酯等来调节等来调节溶剂体系的极性，直到样品在上下相中的分配比溶剂体系的极性，直到样品在上下相中的分配比K K为为0.52为止；为止；（3 3）用）用HPLCHPLC测定测定K K值；值；（4 4）用）用分析型分析型HSCCCHSCCC进行预分离，再用进行预分离，再用制备型高速逆制备型高速逆流色谱流色谱进行分离。进行

9、分离。（1 1）溶剂不造成样品的分解或变性溶剂不造成样品的分解或变性；（2 2）样品在溶剂中有足够高的溶解度样品在溶剂中有足够高的溶解度；（3 3）样品在溶剂系统中有合适的分配系数样品在溶剂系统中有合适的分配系数 值值；（固定相为管柱总体积的；（固定相为管柱总体积的50%50%以以上，分配系数为上，分配系数为0.52）（4 4）固定相能实现足够高的保留固定相能实现足够高的保留。3 3 选择溶剂时应注意选择溶剂时应注意生物碱生物碱氯仿氯仿- -甲醇甲醇-NaH-NaH2 2POPO4 4溶液溶液(pH = 4)(pH = 4)溶剂体系溶剂体系氯仿氯仿- -甲醇甲醇- -盐酸体系盐酸体系异丁基甲醚

10、异丁基甲醚- -四氢呋喃四氢呋喃- -水体系水体系异丁基甲醚异丁基甲醚- -水体系水体系正己烷正己烷- -乙醇乙醇- -水体系水体系正己烷正己烷- -醋酸乙酯醋酸乙酯- -水水正己烷正己烷- -醋酸乙酯醋酸乙酯- -甲醇甲醇- -水水4 4 不同物质的溶剂体系不同物质的溶剂体系黄黄酮酮类类化化合合物物正己烷正己烷- -醋酸乙酯醋酸乙酯- -甲醇甲醇- -水水正丁醇正丁醇- -醋酸乙酯醋酸乙酯- -水水氯仿氯仿- -甲醇甲醇- -水水正己烷正己烷- -醋酸乙酯醋酸乙酯- -正丁醇正丁醇- -甲醇甲醇- -醋酸醋酸- -水水正己烷正己烷- -醋酸乙酯醋酸乙酯- -甲醇甲醇- -水水萜类萜类异辛烷异

11、辛烷- -乙酸乙酯乙酸乙酯- -甲醇甲醇- -水水异辛烷异辛烷- -甲醇甲醇- -水水氯仿氯仿- -甲醇甲醇- -水水木脂素和香豆素木脂素和香豆素氯仿氯仿- -甲醇甲醇- -水水正己烷正己烷- -乙睛乙睛- -醋酸乙酯醋酸乙酯- -水水正己烷正己烷- -甲醇甲醇- -水水氯仿氯仿- -甲醇甲醇- -水水高速逆流色谱技术的应用领域高速逆流色谱技术的应用领域1 高速逆流色谱在中药现代化中的应用高速逆流色谱在中药现代化中的应用2 高速逆流色谱在抗生素分离纯化中的应用高速逆流色谱在抗生素分离纯化中的应用3 高速逆流色谱在异构体分离纯化中的应用高速逆流色谱在异构体分离纯化中的应用4 高速逆流色谱在食品行

12、业中的应用高速逆流色谱在食品行业中的应用5 高速逆流色谱在化学合成中的应用高速逆流色谱在化学合成中的应用6 高速逆流色谱在生物领域中的应用高速逆流色谱在生物领域中的应用7 高速逆流色谱在发酵产物分离纯化中的应用高速逆流色谱在发酵产物分离纯化中的应用成药质量控制成药质量控制 指纹图谱指纹图谱指导原药材种植指导原药材种植/GAP基地建设基地建设单体化合物单体化合物用于制药中间体的质用于制药中间体的质量控制量控制 HSCCC在中药中各类单体的制备均有应用，经在中药中各类单体的制备均有应用，经过简单的前处理（提取、萃取或大孔树脂柱）后过简单的前处理（提取、萃取或大孔树脂柱）后直接上样，一次分离就能得到

13、高纯度和高得率的直接上样，一次分离就能得到高纯度和高得率的单体，已成为天然产物分离纯化中有效的不可替单体，已成为天然产物分离纯化中有效的不可替代的分离方法。代的分离方法。02040608010012014001234567891011121314Time (h)Absorbance (OD280nm)0102030400100200mAU (280nm)Time (min) 01020304004080120160mAU (280nm)Time (min) 0102030400100200mAU (280nm)Time (min) B1B2B305010015020025001234567891011121314Time (h)Absorbance (OD280nm)02040608010001234567891011121314Time (h)Absorbance (OD280nm)A1A2A3HSCCCHSCCC图谱图谱