子宫内缺氧对子代大鼠老年期脑白质MBP、NF-H L表达的影响

1、    子宫内缺氧对子代大鼠老年期脑白质MBP、NF-H+L表达的影响作者：王凌星 蔡若蔚 吕国荣 作者单位：福建医科大学附属第二医院神经内科，福建 泉州 362000【摘要】 目的 探讨子宫内缺氧对子代大鼠老年期脑白质髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein，MBP)、神经微丝H+L(neurofilament-H+L，NF-H+L)表达的影响。方法 建立SD大鼠宫内缺氧模型，免疫组化检测子代大鼠老年期脑室旁白质MBP、NF-H+L表达并行图像分析;电镜下观察子代大鼠脑内髓鞘、轴突、微血管的超微结构。结果 宫内缺氧的主效应可使子代大鼠老年

2、期脑白质的MBP、NF-H+L表达减少(均P<0.05)，MBP与NF-H+L呈高度正相关(R2=0.64，P<0.01)。电镜观察，与空白对照组相比，宫内缺氧组子代大鼠老年期脑内可见较多的髓鞘脱失、轴突受损、微血管病变。结论 宫内缺氧可影响子代大鼠老年期脑白质MBP、NF-H+L表达，出现髓鞘脱失、轴突受损。【关键词】 宫内缺氧;老年期;髓鞘碱性蛋白;神经微丝H+L基金项目：福建医科大学科研发展基金项目(FJGXY04023)1993年Barker等1提出成年疾病的胎儿起源假说，认为妊娠期胎儿营养不良会导致代谢、生理和结构参数的持久改变，引起生命后期的疾病发生。此后的研究表明围生

3、期不利营养因素与成年心血管疾病、高血压、2型糖尿病和脑血管疾病相关，这些不利因素包括母亲的营养缺乏、情绪压力和胎儿缺氧等2。随着影像学技术的广泛应用，脑白质病变，如白质疏松的诊断率越来越高，而且白质病变与卒中、痴呆相关3，其重要性受到越来越广泛关注。本研究旨在观察宫内缺氧对子代大鼠老年期脑白质髓鞘及轴突的影响。1 材料与方法1.1 材料 SD孕鼠60只由福建医科大学实验动物中心提供;75 cm×65 cm×35 cm的缺氧箱一个;S-450型氧气检测报警仪一台(IST-ATM公司生产);OlympusBH-2照相显微镜(福建医科大学解剖教研室提供);Motic图像分析仪(福

4、建医科大学解剖教研室提供);飞利浦EM208型透射电镜(福建医科大学电镜室提供);MBP 抗体及NF-H 抗体(均由美国Dako公司提供);KIT-5001及 KIT-5004即用型快速免疫组化MaxVisionTM 检测试剂盒(均购自福州迈新生物技术开发公司);医用压缩氧气(浓度>99%)，压缩氮气(浓度>99%)(由泉州制氧厂提供)。1.2 方法表1 三因素两水平正交设计表(略)“+”为追加缺氧;“-”为未追加缺氧1.3 统计学处理 实验数据以x±s表示，SPSS11.0软件进行统计学处理。分析前均行正态性检验和方差齐性检验。2 结果2.1 孕鼠脐血血气分析 孕鼠缺氧

5、1 h后pH值、SaO2下降，PaCO2升高，PaO2明显下降，实验组与对照组孕鼠脐血的pH值、PaCO2、PaO2、SaO2差异显著，提示建模成功(表2)。表2 孕鼠脐血血气分析均值(略)与对照组比较：1)P<0.052.2 子代大鼠老年期脑室旁白质MBP、NF-H+L的变化 MBP主要表达于脑室旁白质的髓鞘，呈棕黄色。在对照组，可见突起呈条索状，较长且连续，形状细直，排列规整。在实验组，白质MBP表达出现断裂、不连续，或弯曲变形，排列尚可。在宫内缺氧+追加缺氧+高脂饮食组，白质MBP表达进一步减少，呈点、碎屑状分布，排列极其紊乱。NF-H+L表达于脑室旁白质的神经纤维内，呈棕黄色。在

6、对照组，可见突起呈长丝状，形状细直，排列规整。在实验组，白质NF-H+L的长丝状表达出现断裂，部分弯曲，排列尚可(图1)。在宫内缺氧+追加缺氧+高脂饮食组，白质NF-H+L表达进一步减少，断裂呈线头状分布，明显变形，排列紊乱。2.3 子代大鼠老年期脑室旁白质MBP、NF-H+L的表达 见表3。宫内缺氧、追加缺氧、高脂饮食三因素均使子代大鼠脑白质的MBP、NF-H+L表达减少，其中宫内缺氧与高脂饮食、宫内缺氧与追加缺氧、高脂饮食与追加缺氧间存在一阶交互作用(均P<0.05)，宫内缺氧、高脂饮食与追加缺氧三因素间存在二阶交互作用(P<0.05)，导致白质MBP、NF-H+L表达进一步减

7、少。子代大鼠老年期脑室旁白质MBP和NF-H+L累积光密度的相关性分析：子代大鼠脑室旁白质MBP与NF-H+L累积光密度呈高度正相关，r=0.837，R2=0.64，P<0.01(图2)。2.4 超微结构观察 每份标本随机选取五个视野进行观察，对照组子代大鼠老年期脑内神经髓鞘呈明暗相间的同心圆板层结构(图3A);轴突表面光滑连续，轴突内可见微丝，线粒体结构完整(图3A);血管内膜光滑无增厚，管腔完整(图4A)。实验组可见：髓鞘脱失：内层或外层局灶性板层松解使髓鞘呈链状剥脱、断裂、变厚(图3B)。轴突受损：部分肿胀、粗细不均或弯曲，轴突内线粒体变性，神经微丝增多积聚(图3B)。脑微血管病变

8、：血管内皮细胞变性，内膜增厚，管腔狭窄(图4B)。表3 子代大鼠脑室旁白质区MBP、NF-H+L阳性信号的累积光密度情况(略)与空白对照组比较：1)P<0.05表4 宫内缺氧、追加缺氧、高脂饮食对子代大鼠老年期脑室旁白质MBP、NF-H+L累积光密度的影响(略)图1 MBP及NF-H+L免疫组化表达(DAB染色，×400)(略)图2 MBP和NF-H+L累积光密度(IOD)的分布情况(略)图3 脑内神经髓鞘及轴突(铀铅双染色)(略)图4 脑内微血管(铀铅双染色)(略)3 讨论脑白质主要由神经轴索构成，主要成分是髓鞘、轴突和神经胶质7。轴突为髓鞘所包盖，髓鞘对神经元轴突具有“屏蔽

9、”作用，可以防止神经纤维在传导冲动时的相互干扰，以保证其传导的精确性。构成髓鞘的蛋白质中MBP约占总量的1/37。NF是轴突骨架结构的重要组成部分,由低分子量(NF-L，68 kD)、中分子量(NF-M，160 kD)和高分子量 (NF-H，200 kD)三种多肽亚单位组成，NF-L跟NF-M 或NF-H一起组成一种特定的二聚体8。我们用 MBP、NF-H+L分别代表白质中髓鞘、轴突的受损情况。实验中对照组子代大鼠脑白质MBP、NF-H+L表达长且连续，排列规整，超微结构示髓鞘呈明暗相间的同心圆板层结构，轴突表面光滑连续，说明髓鞘发育正常。宫内缺氧的主效应使子代大鼠老年期脑白质的MBP、NF-

10、H+L出现断裂、表达减少，说明宫内缺氧会导致持久有害的影响，引起老年期脑白质的髓鞘和轴突损害。而超微结构观察进一步证实了宫内缺氧组脑白质存在髓鞘脱失、轴突受损。宫内缺氧与高脂饮食、宫内缺氧与追加缺氧的一阶交互作用，宫内缺氧、高脂饮食与追加缺氧间的二阶交互作用均可增加这种改变。Barker1认为成年疾病的发生与胎儿期宫内条件不良关系密切，与后天的环境因素同样密不可分。敏感、关键发育阶段的刺激或损伤产生长期影响，且这种影响可以被许多后天的环境因素放大，从而增强和加速成人疾病的进展过程9。本实验的结果也证实了后天不利环境(追加缺氧和/或高脂饮食)会加重宫内缺氧对子代大鼠老年期脑白质的影响。已有研究发

11、现2：慢性宫内缺氧时，胎儿心输出量减少，但通过重新分配心输出量，使胎儿保持几乎正常的脑血流量及氧传递。在胎儿这种适应缺氧过程中，脑血流量的维持除了脑血管阻力的适度增加外，还发现有脑动脉及其平滑肌细胞结构及构成的改变，即大脑中动脉除了增加血管壁厚度外，尚有血管平滑肌的增殖，以及血管周围神经支配的增加。另有研究发现宫内缺氧会引起子代大鼠出生后颈动脉对苯肾上腺素收缩功能减退10。我们的实验观察到宫内缺氧可导致脑微血管病变，推测这种子代血管变化正是宫内缺氧对脑血管的远期影响。脑室壁周围310 mm范围是白质区域的“远端供血区”，即动脉供血的分水岭区，特别易受全身或局灶性脑血流降低的损害。脑微血管病变可

12、能导致分水岭区血流量减少，这种减少没有严重到引起局灶梗塞，但却可能影响少突胶质细胞的功能。因为少突胶质细胞的缺血缺氧易损性远远大于构成白质的其他细胞11，少突胶质细胞的情况直接影响髓鞘的形成，出现MBP表达减少。MBP减少的另一个可能原因是：构成 MBP 蛋白质的水解逐渐增强。已有文献报道缺血缺氧可激活钙依赖蛋白酶12，另有一项视神经缺氧的研究表明7，缺氧引发钙异常流入有髓鞘的轴突，激活蛋白质水解酶，破坏了构成 MBP的蛋白，使 MBP 减少。脑微血管病变可能导致分水岭区血流量减少，增强MBP蛋白质水解，导致脑白质髓鞘损害。本实验中子代大鼠脑室旁白质MBP与NF-H+L的相关性分析提示呈高度正

13、相关，这说明髓鞘脱失与轴突损害具有内在的联系。已有报道13认为髓鞘通过调节神经微丝和其他底物的磷酸代谢直接影响神经轴突的功能;在动物实验7中也发现慢性脑组织低灌注状态下髓鞘损坏先于轴突，并可能是轴突损伤的原因。因此，髓鞘的改变可能通过同样的机制影响轴突的完整性。另外本实验中宫内缺氧组轴突内线粒体变性，线粒体的这种改变可能导致细胞色素C释放，破坏轴突细胞骨架、细胞器12，这可能是轴突损伤的另一个原因。宫内缺氧引起脑白质损害的机制尚不完全清楚，我们推测宫内缺氧可能通过影响血管导致脑白质损伤。白质中髓鞘病变是老化的常见特征，参与老化相关疾病的发生，轴突结构变化可能是老化过程中认知功能障碍的重要大原因

14、14。宫内缺氧可能加重子代大鼠老年期脑的老化，并进而影响认知功能。【参考文献】1 Barker DJ.Fetal origins of coronary heart diseaseJ.BMJ,1995;311(6998):171-4.2 Longo LD,Pearce WJ.Fetal cerebrovascular acclimatization responses to high-altitude，long-term hypoxia：a model for prenatal programming of adult diseaseJ?Am J Physiol Regul Integr Co

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