内毒素诱发肝硬化大鼠发生肝性脑病的实验研究

1、内毒素诱发肝硬化大鼠发生肝性脑病的实验研究摘要目的：观察外源性内毒素诱发肝硬化大鼠发生肝性脑病的可能性及可能机制。方法：采用腹腔内小剂量内毒素一次性注射(300g/100g BW)诱发肝硬化大鼠发生肝性脑病。结果：小剂量内毒素腹腔内注射可以诱发肝硬化大鼠发生肝性脑病。内毒素注射后，动物一般行为状态及脑电皆有明显变化，与其他肝性脑病模型或肝性脑病病人类似。同时，血氨和胰高血糖素水平显著升高。血浆内毒素含量与血氨、血胰高血糖素含量之间及血氨与血及脑匀浆谷氨酰胺含量之间皆存在明显的正相关。结论：内毒素血症可通过其本身的直接作用或通过胰高血糖素血症导致血氨水平的增高。高氨血症时，氨很可能通过其在脑内的

2、代谢产物谷氨酰胺而最终影响中枢神经系统的功能、导致脑病的发生。高氨血症是内毒素诱发肝性脑病发生的主要环节之一。关键词内毒素类； 肝硬化； 肝性脑病； 氨 Hepatic encephalopathy in cirrhotic rats induced by endotoxin injectionLI Xia-Qing, HAN De-Wu, XU Rui-Ling, ZHAO Yuan-Chang, MA Xue-HuiDept.of Pathophysiology,Shanxi Medical University,Taiyuan(030001)AbstractAIM:To establis

3、hed a rats cirrhotic model by a small dose of endotoxin injection peritoneally and clarify its possible pathogenesis.METHODS:The hepatic encephalopathy in cirrhotic rats was induced by a dose(300 g/100 g BW) of endotoxin injection into the rat peritoneal cavity.RESULTS:The endotoxin injection induce

4、d cirrhotic rats to develop hepatic encephalopathy.Some obvious changes in behaviors and electroencephalograph appeared.Besides,marked elevation in the concentration of plasma ammonia and glucagon were seen.Meanwhile,the glutamine content in plasma and brain homogenate was increased.There was a posi

5、tive correlation between plasma endotoxemia and plasma ammonia or glucagon content.The elevated plasma ammonia was also positively related to the high plasma and brain glutamine content.CONCLUSIONS：Endotoxemia was resulted in hyperammonemia by various ways including stimulating the secretion of gluc

6、agon,which is one of the stress reactions happened in endotoxemia.Hyperammonemia might induced hepatic encephalopathy development by glutamine,one of its metabolites in brain,or itself.The development of hepatic encephalopathy induced by endotoxin injection to cirrhotic rats may result from dysfunct

7、ion of ammonia metabolism because of endotoxemia.MeSHEndotoxins；Liver cirrhosis; Hepatic encephalopathy; Ammonia慢性肝病晚期(肝硬化)所发生的肝性脑病多属于慢性复发性脑病1，2，常常在诱发因素存在的情况下发生。能够诱发肝性脑病的因素很多，其中各种类型的感染是临床上常见的诱因。严重的慢性肝病患者由于机体的抵抗力及免疫力下降，机体对外界不良刺激的敏感性增加，因此，当局部发生某种感染时极易合并毒血症，譬如：内毒素血症、脓毒血症等。然而，严重感染时所形成的内毒素血症是否与肝性脑病的发生有关，

8、因缺乏实验依据不能定论。为此，我们在实验性肝硬化基础上，采用腹腔小剂量内毒素注射造成内毒素血症，诱发肝性脑病发生，以此探讨其内在机制。材料与方法(一)动物：采用雄性Wistar大鼠。体重230250g。本校动物实验中心提供。(二)肝硬化模型复制：采用本室已建立的方法进行4。大体方法：用40%的四氯化碳油溶液每隔3 d行背部皮下注射，同时辅以低蛋白、低胆碱、高脂肪、高醇饮食。实验第6周时早期肝硬化形成；实验第9周时进入中晚期肝硬化阶段。(三)小剂量内毒素注射诱发肝性脑病：肝硬化动物于实验第9周时行腹腔一次性小剂量注射大肠杆菌内毒素(lipopolysaccharide,E.coli.,LPS，上

9、海第二军医大学微生物教研室研制，批号9503)。注射剂量：300g/100 g体重。注射后1h、2h、3h、4h分别测定大鼠脑电(EEG)及观察动物一般行为状态变化，以此判断有无肝性脑病的发生3。为进行对照，另设单纯内毒素注射组(正常大鼠腹腔内注射同等剂量的内毒素)、正常对照组及肝硬化对照组，后两组腹腔内注射同等剂量的无菌生理盐水。所有动物均于同一时间注射，注射前禁食过夜。注射后4h行乙醚麻醉术，腹主动脉采血、活体组织取材分别测定血浆内毒素含量、血氨含量、血胰高血糖素及胰岛素含量、血浆及大脑皮层匀浆谷氨酰胺含量。(四)统计学处理：实验数据采用t检验、t检验及直线相关回归分析处理。数据以均数标准

10、差(s)表示。结果(一)内毒素注射前后动物一般情况及脑电变化：内毒素注射前，动物一般状态良好，反应灵敏，肝硬化动物与正常动物相比无明显差别，脑电正常(1)。内毒素注射后3h，肝硬化动物出现步态蹒跚，捕捉反射、疼痛反射迟钝甚至消失，40%的动物出现运动能力的丧失，34h脑电出现显著改变，类似与临床上肝性脑病的EEG变化(1)：脑电频率变慢，78次s，重者仅45 beatss，电压增高，150270V，甚至可达300V以上。肝性脑病发生率约为80%。内毒素对照组动物在注射内毒素后活动也减少，但反应良好，EEG显示基本正常(1)。(二)血浆内毒素水平及血氨、血浆胰高血糖素含量变化：注射内毒素后4h，

11、正常动物及肝硬化动物血浆内毒素含量都明显高于正常，且内毒素对照组与肝硬化加内毒素组相比其数值间的差值无明显差异。肝硬化动物注射内毒素后血氨水平明显升高(表1)，几乎是正常动物血氨水平两倍以上，而单纯肝硬化动物及内毒素对照组动物血氨水平虽略有上升，但无明显差异(P0.05)。血氨含量变化与血内毒素水平呈正相关(r0.5025，P0.05)。肝硬化动物注射内毒素后，胰高血糖素水平剧烈升高，达到正常动物的10倍以上，而内毒素对照组动物仅呈轻度升高，且无明显差异。血浆胰高血糖素与内毒素水平之间也呈正相关(r0.4622，P0.05)。(三)血及脑匀浆谷氨酰胺含量变化：血及脑匀浆内谷氨酰胺的变化主要以注

12、射内毒素后的肝硬化动物表现明显。血、脑匀浆谷氨酰胺水平皆呈上升趋势，尤以脑匀浆为著(表2)。Fig 1The electroencephalographic(EEG) changes.A.Normal baseline EEG showed low voltage and fast activity;B.In cirrhotic rats,EEG appeared similar to the normals;C.The endotoxin controls,EEG was not different from the normals;D and E.The EEG of cirrhotic

13、rat after 4 h of endotoxin injection,showed marked increase in voltage,with mild slowing or marked slow wave and moderate increased voltage 1各组动物脑电变化表1血氨、胰高血糖素及内毒素测定结果Tab 1The level of plasma ammonia,glucagon and endotoxinGroupnEndotoxin(103EUL）Glucagon(ng/L)Ammonia(mg/L)Normal control90.18950.16004

14、5.0419.061.09920.5192Endotoxin control82.89800.6100*61.5847.251.46830.4387Cirrhosis80.77520.5000*50.7272.161.52780.2827Cirrhosisendotoxin82.79390.2600*756.52208.83*3.82732.5687*?P0.05，?P0.01,vs normal control 表2血浆及脑谷氨酰胺含量变化Tab 2The changes of plasma and cerebral glutamine contentGroupnGlutamine(g/10

15、0 L)PlasmaCerebral homogenateNormal control 918.8412.5622.329.99Endotoxin control820.778.9814.463.27Cirrhosis815.495.3424.4610.12Cirrhosisendotoxin835.156.53*42.299.05*P0.05，vsnormal control 讨论内毒素血症与肝性脑病发生之间的确切关系还不十分清楚。Odeh等人认为，内毒素血症时，主要可影响蛋白质代谢及加重肝脏损伤，内毒素血症与高氨血症可同时并存5。因此推测高血氨可能是内毒素诱发肝性脑病发生的主要机制之一。我

16、们的实验结果表明，在用小剂量内毒素诱发肝硬化大鼠发生肝性脑病时，血氨水平确有显著增加，然而，在血氨水平升高的同时，血浆胰高血糖素水平呈10数倍的增加，成为内毒素注射后最为显著的生化指标之一，且血浆胰高血糖素水平与血浆内毒素血症的程度及血氨水平皆呈正相关。内毒素注射后之所以会引起肝硬化大鼠出现显著的高胰高血糖素虚症，主要与肝硬化动物在长期慢性肝病的发展过程中，机体对不良刺激的敏感性增高有关。因此当注射小剂量内毒素后即可引起十分明显的应激反应，血浆胰高血糖素水平由此而升高。而正常动物机体反应性正常，故对于同等剂量的内毒素注射无明显的内分泌应激反应。据文献报道，血浆胰高血糖素升高后，可引起血氨水平的

17、增高6，如果氨为内毒素诱发肝性脑病创造条件，如果说高血氨是内毒素诱发肝性脑病的主要机制的话，那么，内毒素血症所引起的高胰高血糖素血症对加重高氨血症可能起着重要作用。高血氨、高胰高血糖素血症及内毒素血症三者之间有着不可分割的内在联系。氨具有神经毒性。高血氨与肝性脑病的关系早已为人们所熟知1，2。目前，氨的代谢产物谷氨酰胺在肝性脑病发生机制中的作用已日渐引起重视7。脑内缺乏尿素循环的酶类，故大量的氨在脑内蓄积时，氨的清除主要靠星状胶质细胞内的谷氨酰胺合成酶的作用与谷氨酸合成谷氨酰胺。高氨环境下，谷氨酰胺的合成增加，但是神经细胞对其利用减少，因此常导致谷氨酰胺在脑内蓄积。谷氨酰胺被认为具有渗透分子作

18、用，细胞内谷氨酰胺增多可继发细胞内水分的积聚，引起细胞水肿8。因此，谷氨酰胺蓄积可能是高氨是脑水肿发生的主要机制之一。当胶质细胞内谷氨酰胺量逐渐增多时，大量的谷氨酰胺将由细胞内逸出，通过血脑屏障而转运到外周循环，被机体的其它组织器官利用；同时通过载体互换机制而促使大量的中性氨基酸入脑。其中芳香族氨基酸入脑后可形成假性神经递质及抑制性神经递质，影响中枢神经系统的功能。综上所述，内毒素作为诱因可以通过高氨机制诱发肝硬化大鼠发生肝性脑病。内毒素血症可通过多种途径引起血氨升高，其中高胰高血糖素血症可能起了一定的作用。作者单位:山西医科大学病理生理学教研室(太原030001)参考文献1韩德五.肝性脑病.

19、见：韩德五，主编.肝脏病理生理学.第1版.太原：山西高校联出版社，1992.413454.2Mousseau DD,Butterworth RF.Current theories on the pathogenesis of hepatic encephalopathy.PSEBM.,1994,206:329.3Oppong KNW,Bartlett K,Record CO,et al.Synaptosomal glutamate transport in thioacetamine-induced hepatic encephalopathy in the rat.Hepatology,1995,22:553.4韩德五，五学惠，赵元昌.肝硬化动物模型的研究.山西医药杂志，1979，(4):1.5Odeh M.Endotoxin and tumor necrosis factor in the pathogenesis of hepatic encephalopathy.J Clin Gastroenterol,1994,19:146.6Kabadi