端粒酶检测方法研究进展

1、文章编号:1007-4287(200503-0477-04端粒酶检测方法研究进展张传宝1,郭健1,张克坚2(1.北京医院卫生部临床检验中心,北京100730;2.国家药品监督管理局药品审评中心端粒酶与人类恶性肿瘤之间的紧密联系使它成为目前已知的最为广泛的肿瘤分子标记物之一,端粒酶的检测对癌症的早期发现、发展和预后有重大意义。端粒酶检测方法从原始的端粒重复序列延伸到TRAP,以及现在采用的定量实时荧光RT2PCR方法,从粗略定性逐渐发展为现在的准确定量,方法稳定性、可靠性逐渐完善,操作也变得更为简便。本文就端粒酶的测定方法的研究进展进行介绍。1端粒重复序列延伸方法(T elomere exten

2、sion assay M orin等1于1989建立此方法,是根据端粒酶能合成、延伸端粒特性而设计的。主要原理是:首先从新鲜或-70冻存的细胞中制备S2100提取液,因端粒酶含RNA组分,在提取及检测过程中要求无RNA操作,防止模板RNA降解。而后进行端粒重复序列合成,加入(TT AGGG3引物,合成延伸TT AGGG重复序列。反应液中,含2m M dATP,2m M dTTP, 3m M a232P dG TP,使同位素掺入。反应需30,60分钟,而后用011mgml RNA酶终止。RNA酶可使端粒酶RNA降解,失去模板作用,从而导致端粒酶失活。将产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,放射自显影,阳性

3、标本可见梯形条带。此方法系最早建立的方法,稳定性好,特异性高;缺点是需要样品量较大,灵敏性差,检测时间长,不适合临床标本的大量检测,另外在实验中同位素的用量较大,对试验人员的身体有危害。2端粒酶重复序列扩增方法(TRAPK im等2于1994年建立此方法,是将端粒延伸方法同PCR技术结合而建立的一种方法。其检测要点是:1从肿瘤组织或细胞中制备S2100提取液;2端粒酶重复序列延伸:在反应缓冲液中加入dNTPs和TS(52AAT CCG T CG AG C AG A GG T23引物,然后加入微量端粒酶提取液。TS引物是18bp 的寡核苷酸,端粒酶可与TS相结合,以其本身的RNA组份(hTP作为

4、模板,在TS的3端合成延伸TT AGGG重复序列;3PCR反应:以延伸反应合成的产物作为模板,加入另一条引物CX(52CCCTT ACCCTT ACCCTT ACCCT AA23和T aq酶酸,此时TS引物作为上游引物,CX作为下游引物。通过PCR扩增出相差6个bp的不同长度端粒重复序列片断,在PCR体系中掺入32P2dATP,以标记反应产物。扩增产物经15%聚丙烯酰胺凝胶电泳,放射自显影分析结果。或在反应中不加放射性同位素,直接电泳,而后通过硝酸银染色3观察结果。该方法将端粒重复序列延伸与PCR技术巧妙结合。所需标本微少,敏感性大大提高近103以上。可检出10个以下的细胞,适合于大量检测。其

5、缺点是:1定量困难;2检测时可能因标本中T aq抑制剂的影响,出现假阴性结果。3TRAP改良方法TRAP是测定端粒酶活性最常用的检测方法,因其存在定量困难和易受T aq酶影响而出现假阴性结果的缺点,有学者针对这两点进行了改进:一是加入内对照,防止假阴性结果;二是与免疫荧光等技术结合使其易于定量。311加内对照TRAP法Wright等4于1995年报道此法,主要原理是以150bp大鼠肌浆蛋白基因片断为内对照,设计TS、CX与肌浆蛋白的复合引物,进行PCR扩增,扩增产物的5和3端分别含有TS 与CX序列。在TRAP检测时,加入此扩增产物作为内对照模板,结果可见186bp内对照带,如果内对照带不出现

6、,则提示PCR反应存在问题,从而可以排出假阴性结果。312端粒酶重复序列扩增2闪烁亲近法(TRAP2SPA Ericka Sav oyshy等5将TRAP与闪烁亲近法(Scintillation proximity assay,SPA结合,建立了测定端粒酶活性的TRAP2 SPA方法。他们将K im最初创立的TRAP法作了如下改变:用生物素标记CX引物5(Bio2CX,而dATP、dCTP和dG TP浓度保持在50M。dTTP浓度降为2M,用2CiMe23H替代232PdG TP,反应中通常不需要T4g32蛋白,其他成分保持不变。反应产物(40l与亲和素标记的荧光微球(50l混合37孵育10m

7、in,使生物素标记3H掺入的扩增产物与荧光微球结合,最后用闪烁计数仪计数。该方法检测速度快,大约需要2h。敏感性强,特异性高,可定量:样本量大时,可在96孔板上进行测定。缺点是需要特殊仪器,不利于推广。313荧光素标记的端粒酶重复序列扩增法Ohyashiki等6应用荧光素标记TS引物进行端粒酶重复序列扩增,这样扩增产物均标记有荧光素,产物用8%的变性胶电泳后,用DNA自动测序仪测定得到荧光曲线,用片断管理系统(fragment manager system根据峰宽度、峰高、峰面积对每个荧光曲线峰进行定量分析。荧光曲线的高和面积与扩增的端粒重复序列产物相关,据此可测定端粒酶活性。此方法可以半定量

8、,并可在90min内得到结果。由于片断管理系统的检测限很低,对低水平的端粒酶活性定量测定结果不可靠,只能判断低水平端粒酶表达的有无。1997年Ohyashiki 等又设计了原位TRAP法,利用31SUTP标记单股RNA探针,对细胞内端粒酶活性进行定量检测。314TRAP2E LISA法1996年,宝灵曼(现为罗氏公司公司向市场推出了利用地高辛标记探针,用于半定量测定端粒酶活性的试剂盒。其基本原理是TS引物5端标以生物素,经端粒酶延伸反应,PCR扩增后,将产物变性,加入地高辛标记的可与扩增产物的重复片断结合的探针。在该检测反应中,PCR产物可经生物素标记的引物固定到亲和素包被的微孔板上,而探针上

9、的地高辛与过氧化物酶标记的抗地高辛抗体相结合,最后经过过氧化物酶分解底物T M D形成一种有色的反应物,再用酶标仪进行测定。该方法检测灵敏度高,同放射性同位素TRAP测定相当,该方法极大地简化了PCR产物检测操作步骤,由于采用试剂盒,较为简便。反应总共需要68h。国内学者王惠民等7发现宝灵曼公司的TRAP2E LIS A试剂盒不同批号间可能会出现较大差异,并且试剂价格较为昂贵。于是,他们使用荧光素2抗荧光素体系代替了地高辛2抗地高辛偶联法,其他的原理基本相同,也取得了较好效果。4杂交保护法(hybridization protection assay,HPA David Bruce Lacke

10、y8在1998年报道用杂交保护法(HPA测定端粒酶活性的方法,本方法最关键的地方在于,它采用了一种用丫啶酯标记的寡核苷酸探针,此探针和端粒酶延伸反应的产物杂交,在碱性(NaOH条件下,没有和反应产物杂交的探针被碱水解,丫啶酯被水解下来。但是和产物杂交的探针被保护起来,丫啶酯不会被水解,在H2O2的作用下,产生化学发光,利用化学发光仪检测光的强度,通过和标准曲线比较,可以定量测定端粒酶的活性。该方法由于没有PCR 扩增过程,灵敏度比TRAP低,但是它的特异性高,反应时间短,只需要1h,并且不受T aq酶抑制剂的影响,不易出现假阴性结果。是一种简便易行的方法。其主要步骤如下: a1制备细胞端粒酶提

11、取液(同TRAPb1在反应缓冲液中,加入dNTP,引物(TT AGGG2,端粒酶提取液(含端粒酶,进行端粒栈催化的延伸反应c1加入丫啶酯(AE标记的探针(52AA(CCCTT A423进行杂交反应,在实验设定的条件下,和产物(TT AGGG4结合的探针能被有效保护而不被碱水解,而(TT AGGG8保护效率是(TT AGGG4的2倍。杂交后加碱(NaOH,H2O2进行化学发光法检测。d1标准曲线是以一系列浓度的(TT AGGG4以HPA测定,减去空白后做成的浓度化学发光强度曲线。本方法中,端粒酶活性单位的定义为:在30,30合成1fm ol (TT AGGG4的酶量为1U。5转录介导的扩增杂交保

12、护法(T ranscription2mediated am2 plification and hybridization protection assay,TMAHPA 1998年Hirose等9建立了此方法。整个反应分为三部分:端粒酶延伸反应、转录介导的扩增(T M A过程和HPA检测过程。其中第一步和第三步反应过程和HPA法基本相同。a1端粒酶延伸反应:制备端粒酶提取液、进行延伸反应,方法同TRAP。这里运用了一种特殊的引物:启动子引物,它除了包含端粒酶的底物序列,从而使端粒酶可以在其3合成延伸TT AGGG序列外,还包含了T7RNA聚合酶的启动子序列,可以被T7RNA聚合酶识别,启动转录

13、反应;b1反向引物与延伸反应的产物单链DNA结合,在反转录酶RT ase的作用下形成双链DNA;c1T7RNA聚合酶识别DNA序列中的启动子序列,开始转录反应过程,合成RNA;d1反向引物与转录反应合成的RNA特异结合,在反转录酶的作用下,合成cDNA,形成DNARNA杂和双链,由于逆转录酶具有RNaseH活性,双链上的RNA链被降解。启动子引物和DNA特异结合,在逆转录酶的作用下,催化合成DNA 双链;e1由于每个DNA模板可以产生1001000个RNA拷贝。这个扩增过程可以产生100亿个扩增子。整个扩增反应过程在同一温度下,由酶自动催化进行;f1HPA检测过程:丫啶酯标记的探针与产物杂交,

14、化学发光检测。本方法除了保持HPA法的特异性高、不易受外界污染的优点外,它的灵敏度较HPA有了较大的提高。HPA和T M AHPA方法虽然简便易行,特异性高,但是由于丫啶酯标记的探针是美国GE N2PROBE公司的专利技术,在国内购买不方便,也没有能够提供合成服务的公司,另外此方法需要化学发光仪,该方法不易推广,笔者尚未见到国内学者使用此方法的报道。6实时定量荧光PCR方法测定hTR和hTERT mRNA 人类端粒酶包括3个主要部分,即人端粒酶RNA(hTR,端粒酶相关蛋白(TP1和人端粒酶催化亚单位(hTERT,hTR 在所有的细胞中均表达,因此它不能作为端粒酶活性的预测指标;TP1尽管在脑

15、组织中表达相对较弱,但在大多数组织中表达。K y o等10观察了35例卵巢癌,5例低度恶性肿瘤, 11例良性病变和12例正常组织,发现hTERT仅表达在卵巢癌,而hTR和TP1在癌性和非癌性组织中均有表达,提示端粒酶的活性与hTERT相关,不与hTR和TP1相关。hTERT上调对卵巢癌的发生起重要作用。同样Sumida等11对26例口腔恶性肿瘤的分析也表现出hTERT与端粒酶活性紧密相联系,并提示检测hTERT用RT2PCR比TRAP更为灵敏和准确。T chirkov12等人研究发现,hTERT mRNA的数量与G S M 密切相关,可以作为其的诊断预后指标。近两年此类的报道还有许多1315。

16、对hTR和hTERT的测定多采用实时荧光定量PCR技术。实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosys2 tems公司推出。所谓实时荧光定量PCR技术,是指在PCR 反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR过程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR技术主要测定模式有SY BR染料掺入检测模式,杂交探针检测模式和水解探针(T aqMan检测模式。611hTR的测定Y ajima16等人采用T ap Man水解探针检测方法对hTR进行了定量测定。其主要原理是在PCR扩增时加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光寡核苷酸探针,该探针两

17、端分别标记一个荧光发光分子和一个荧光淬灭分子。在激发光作用下,发光分子所产生的荧光可被淬灭分子吸收,因而检测不到荧光。PCR扩增时,T aq酶的523外切酶活性将探针酶切3降解,使荧光发光分子与荧光淬灭分子分开,在激发光作用下,即可发出荧光,被检测系统接收。每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的积累与PCR产物形成完全同步。从而可以定量检测hTR。612hTERT mRNA的测定Y i17和Schrader等1821用杂交探针检测模式进行测定细胞中hTERT mRNA的含量,他们采用的是R oche公司Light2 Cycler T elo T AGGG hTERT Qua

18、ntification K it。其主要原理是:通过一步法RT2PCR,将hTERT mRNA进行逆转录,利用特异性的引物,扩增出一段198bp长度的cDNA。然后使用一对特异的杂交探针,对这一扩增子进行荧光检测。这里使用的杂交探针是两条不同序列的寡核苷酸,在扩增反应循环的退火阶段,可以特异地结合到扩增产物中间的一段序列上。其中一条探针在3端带有一荧光素标记,另一条探针5端标记了LightCycler2Red640,将其3末端磷酸化以防止延伸反应的发生。这两条探针的序列经设计,只有同扩增出的DNA杂交后,两条探针才能相互靠近,在它们之间进行荧光共振能量转移(FRET。在FRET过程中,Ligh

19、tCycler仪器产生的光源首先刺激作为供体的荧光燃料,该供体然后会发光刺激在附近的受体荧光燃料LightCycler2Red640,该受体再放出另一波长的荧光,LightCycler仪器对此波长进行检测。该方法可以定量检测hTERT mRNA的含量,除去处理样品的时间,只需45分钟就可得到结果。LightCycler T elo T AGGG hTERT Quantification K it灵敏度高,可以检测10个拷贝的mRNA,在102106拷贝范围内表现出良好的线性,该方法重复性好,是一种可靠的测定方法。缺点是试剂盒价格昂贵,成本较高。从M orin于1989年建立端粒重复序列延伸方法

20、到现在,已过去了14年,端粒酶的测定方法不下10种,但是最常用的也是文献报道中最多的主要有两种,一种是前几年大家普遍采用TRAP测定端粒酶催化活性的方法,另外一种是近两年国外文献中报道较多的定量荧光实时RT2PCR测定端粒酶催化亚单位(hTERTmRNA的方法,利用此方法的可以准确定量的优点,动态检测肿瘤的发生、发展过程中端粒酶的变化,以及癌症患者在治疗过程中端粒酶的变化,将成为癌症患者的早期诊断、治疗以及预后的重要指标。可以说,该方法加快了端粒酶的研究从实验室迈向临床应用的步伐,端粒酶在肿瘤的研究中将展现更大的应用前景,为人类攻克肿瘤这一难题开辟新的视野。参考文献:1M akarov V L

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33、lomerase in tes2 ticular tiuuse specimens predicts success ful sperm recoveryJ.Hum Reprod,2002,17(1:150.(收稿日期:2003-05-23文章编号:1007-4287(200503-0480-02糖尿病肾病中过氧化物酶体增殖物激活受体作用的研究进展郭延军,石益海,李云,刘翠英,高秀丽,边晓霞(大庆市第一医院,黑龙江大庆163001有报道T NF2、S VC AM21、PC AN、PAI21可能参与了糖尿病肾病的发病过程,最近研究发现核转录因子、PPARs是多种信号转导途径的交叉点,参与调控脂类

34、和糖类的代谢,尤其在糖尿病肾病分子机制中起重要作用。现本文就PPARs 结构与分布以及对肾脏细胞生长反应方面的调节等方面作一综述。1结构及其在肾组织分布PPARs是一组核激素受体,属II型核受体超家族成员之一,PPARs的重要作用在于调节参与脂代谢、脂肪酸转运,糖代谢以及细胞的分解代谢和储存。PPARs有3个亚型, PPAR2,PPAR2,以及PPAR21,在人体各种组织,PPAR2又有PPAR1,PPAR2,PPAR33种亚型表达。人类PPAR基因位于3号染色体3P25区。PPAR2是由468个氨基酸组成, PPAR2由441个氨基酸组成,PPAR2有479个氨基酸组成。其中PPAR基因长约100kb,由9个外显子组成。人类PPAR2比PPAR1在氨基酸末端多28个氨基酸。2PPAR s的配体(激动剂和抑制剂PPAR中含有配体结合域,可与配体(激动剂结合后,与视黄酸类受体RXR形成异二聚体,从而作为转录因子调控脂肪形成以及胰岛素依赖的糖代谢2。PPAR2激动剂:长链脂肪酸、氯贝丁酯、82羟基二十碳四烯酸(82HETE, WY14654、WY1