瑞森生物克伦特罗(Clenbuterol)快速检测试剂盒说明书

1、广州瑞森生物科技有限公司克伦特罗（Clenbuterol）快速检测试剂盒说明书【原 理】本试剂盒采用直接竞争ELISA方法检测猪尿和猪肝等样本中的克伦特罗，在微孔条上预包被上单克隆抗体，利用抗体与酶标抗原的特异性免疫化学反应的原理来进行的，样本中的克伦特罗和酶标抗原竞争结合包被的单克隆抗体后，用TMB底物显色，样品中的克伦特罗含量与样品的吸光度值呈反比，与标准曲线比较即可得出克伦特罗含量。【试剂盒组份】1、 酶联板：8孔/条，12条/板2、 3、 酶标记物10ml4、 显色剂A 7 ml5、 显色剂B 7 ml6、 终 止 液 7 ml7、 20浓缩洗液 50ml【试剂盒技术指标】试剂盒灵敏度

2、：样本检测下限：组 织 1ppb饲 料 50ppb交叉反应率：克伦特罗100%特普他林0.1%沙丁胺醇0.1%西马特罗0. 1%回收率：尿样、血清 95%15%组 织 95%15%饲 料 95%15%批间、批内变异系数：CV10%【 所需仪器和试剂】所需仪器：微孔酶标仪、氮气吹干装置、打印机、均质器 、振荡器、离心机、恒温箱、天平（感量0.01g）、刻度移液管、微量移液器(单道20l-200l、100l-1000l、多道250l所需试剂：甲醇、氢氧化钠、乙酸乙酯、正己烷、浓HCl、磷酸二氢钾、乙腈【样本前处理】样本处理前须知：（1）实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。（2）

3、实验之前须检查各种实验器具是否干净，必要时可对实验器具进行清洁，以避免污染干扰实验结果。样本前处理需配制溶液：2、50mM磷酸二氢钾缓冲液（pH3.0）：取3.40g磷酸二氢钾加水定容至500ml（若pH没有在规定范围内，请用磷酸或氢氧化钠调节）。3、500mM磷酸二氢钾缓冲液（pH3.0）：取34.02g磷酸二氢钾加水定容至500ml（若pH没有在规定范围内，请用磷酸或氢氧化钠调节）。4、0.1M HCl ：取0.86ml浓HCl加水定溶至100ml。5、1M HCl ：8.6ml浓HCl加水定溶至100ml。6、0.1M NaOH ：取0.4 g NaOH加水定溶至100ml。7、1M N

4、aOH ：取4g NaOH加水定溶至100ml。8、乙腈0.1M HCl ： 乙腈:HCl =84：16(V/V尿样、血清样品的处理清亮尿样或血清直接测定，如尿样或血清浑浊须过滤或离心10min（15，4000r/min）直至清亮，暂不使用样本应冷冻保存，但避免反复冻融。猪肝、猪肉等组织样品的回收（方法一）1、 称20.05g组织，加入6ml乙腈0.1MHCl，振荡10min,室温4000r/min以上离心10min。2、 取上清3ml，加入2ml 0.1M NaOH，加入6ml乙酸乙酯，振荡10min，室温4000r/min 以上离心10min。取全部上清于50氮气或空气吹干。3、 加入1m

5、l三蒸水复溶，取20l进行分析。4、 样本稀释倍数：1猪肝、猪肉等组织样品的回收（方法二）1、 5.00.05g粉碎的样品与25ml 50mM HCl混合，振荡1.5h，以达到均质的目的。2、 称6g均质物（相当于1 g组织），加入离心管中,10-15，4000r/min或更高的转速离心15min。3、 转移上清液到另一个离心管中，加入 300l1M NaOH混合15min。4、 加入4ml 500mM 磷酸二氢钾缓冲液pH3.0，简单的混合后在4保存，至少1.5h或过夜。5、 10-15，4000r/min或更高的转速离心15min,分离全部上清液（应该是清亮的、非常重要），使其升至室温（2

6、0-24）然后用RIDA C18柱纯化。 6、 样本稀释倍数：1RIDA C18柱的纯化1、 用3ml甲醇（100%）洗涤柱子（1滴/秒）。2、 用2ml洗涤液洗涤柱子（50mM磷酸二氢钾缓冲液，pH3.0）3、 样品进柱（肝，肉或组织的全部上清，15滴/分）4、 用2ml洗涤液洗涤柱子（50mM磷酸二氢钾缓冲液,pH3.0）5、 用正压去除残留的流体并且用空气或氮气吹2min干燥柱子。6、 用甲醇洗脱样品，流速为5滴/分。7、 用50-60的弱空气或氮气流下完全蒸发溶剂。8、 用1ml三蒸水溶解干燥的残留物，取20l进行分析。饲料样品的处理1、 将饲料样品研碎，称2.00.05g研碎的饲料样

7、品，加入2ml 1M HCl，加入16ml去离子水均质。2、 旋流3min，放振荡器上振荡15min3、 离心15min 4000r/min，吸出上清液并加入2ml 1M NaOH至上清液中混合，将pH值调至6-8。4、 离心15min 4000r/min，吸出上清液。（如果上清仍然浑浊可提高转速或用滤纸过滤）。5、 用三蒸水10倍稀释上清液（加100l上清液到0.9ml三蒸水中，并且混合均匀）。6、 取20l进行分析7、 样本稀释倍数:100样品的保存1、 未处理的样品冷冻保存，应避免反复冻融。2、 HCl均质后的样品在2-8稳定3天。3、 以磷酸二氢钾缓冲液提取后的样品（RIDA C18柱

8、纯化之前）在2-8稳定2天，使用前离心。4、 RIDAC18柱纯化步骤所获得的甲醇洗物可冷冻保存2个月,在2-8稳定2周。5、 用三蒸水溶解干燥的残留物在2-8稳定1周。【检测程序】1、 使用前将试剂盒置于室温（20-25）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。取出需要数量的酶标板微孔条插入框架中，将不用的微孔条放入自封袋，保存于2-8不要冷冻；2、 编号：将样品和标准品对应微孔按序编号，每个样品和标准品均需做2孔平行；3、 往酶标板微孔中加入标准溶液或试样液20l/孔，然后加入酶标记物80l/孔，用盖板膜封板，37反应30min。4、 倒出孔中液体，将酶标板倒置在吸水纸上拍打，

9、去除孔中液体。加入250l/孔稀释后洗液（将20浓缩洗液用蒸馏水稀释20倍），15s后倒出孔中液体，用吸水纸拍干，如此重复操作共洗板5次。5、 显色：每孔加入A、B显色剂各50l，轻轻振荡混匀，37避光显色10min；6、 测定：每孔加入终止液50l，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测），测定每孔吸光度值（OD值）。【结果判定】1、定性判定：用样品的平均吸光度值与标准值比较即可得出样本所含克伦特罗浓度范围（ng/ml）。假设样品1的吸光度值为0.313，样品2的吸光度值为1.032，标准液吸光度值分别是：0ppb为1.892；0.1ppb为1.501；0

10、.3ppb为1.175；0.9ppb为0.751； 2.7ppb为0.421； 8.1ppb为0.198。则样品1的浓度范围是2.7ppb-8.1ppb；样品2的浓度范围是0.3ppb-0.9ppb。（再乘以相应的稀释倍数）2、定量判定：所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值（B）除以第一个标准（0标准）的吸光度值（B0）再乘以100%，即百分吸光度值。百分吸光度值（%）B100%B0B标准溶液或样本溶液的平均吸光度值B00ng/ml标准溶液的平均吸光度值以标准品百分吸光率为纵坐标，以克伦特罗标准品浓度（ng/ml）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从

11、标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中克伦特罗实际浓度。若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样品的准确、快速分析。【注意事项】1、 用前将所有试剂温度回升至室温20-25。2、 用之后立即将所有试剂放回2-8冰箱。3、 在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，仔细按照推荐的洗板顺序操作是ELISA测定程序中的要点。4、 所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖板膜封住微孔板。5、 室温低于20或试剂及标本没有回到室温（20-25）会导致所有标准的OD值偏低。6、 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会伴随着出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。7、 混合要均匀，否则会出现重复性不好的现象。8、 反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。9、 不要使用过了有效日期的试剂盒，稀释或搀杂使用会引起灵敏度、OD值的变化。不要交换使用不同批号的盒中试剂。10、 不用的微孔板放进自封袋重新密封；标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此