黄芪对感染病毒大鼠心肌细胞钙通道及钠钙交换载体的效应

1、黄芪对感染病毒大鼠心肌细胞钙通道及钠钙交换载体的效应*摘要目的与方法：以柯萨奇B3病毒感染急性分离的 成年大 鼠心肌细胞，利用膜片钳记录技术了解黄芪对感染柯萨奇病毒后心肌细胞L型钙通道及钠钙 交换载体的影响，以探讨黄芪用于心肌炎治疗的作用机制。结果：黄芪不 影响正常心肌细胞L型钙通道电流的幅度，但可减缓L型钙通道电流的衰减。黄芪也不影响内 向NCE电流，但使外向NCE电流增加，从而使动作电位期间由NCE转运入细胞内的钙离子增加 。病毒感染增加心肌细胞L型钙通道电流的幅度，抑制内向钠钙交换电流，并使钠钙交换电 流的逆转电位负移。黄芪可抑制病毒感染细胞L型钙通道电流的增加， 减轻CVB3对内向NC

2、E电流的抑制作用和 使负移的逆转电位正常化。结论：黄芪通过拮抗CVB3感染对L型钙通道 和钠钙交换电流的影响，可防止病毒感染可能导致的细胞内钙超载和异常电活动，从而对感 染细胞起到保护作用。主题词黄芪；柯萨奇病毒；钙通道；心肌；大鼠； Effects of astragalus membranaceus on L type calcium channel and Na+/Ca2+ exchange in adult rat cardiomyocytesinfected with coxsackie virus B3LIU Gong-Xin,YANG Ying-Zhen,GU Quan-Bao,

3、Guo Qi,Yu YongKey Laboratory of Viral Heart Diseases of Ministry of Public Healt h,Zhongshan Hospital,Shanghai Medical University;Shanghai Institute of Cardiovascular Diseases,Shanghai(200032)Abstract AIM and METHODS:By patch clamp recording techniques to investigate the effects of astragalus membra

4、naceus (AM) on L type voltage dep endent calcium channel (LVDCC) and Na+Ca2 exchange (NCE) in a dult ra t cardiomyocytes infected with coxsackievirus B3(CVB3) so as to understand the mechanism of AM to cure myocarditis.RESULTS：AM did n ot affect the amplitude of calcium current,but decreased the “ru

5、n down”of calc ium current;also,AM had no effect on inward NCE current,but increased outward NC E current.Both of the functions of AM to LVDCC and NCE would increase the calciu m inflow during the action potential. The LVDCC current in rat cardiomyocytes in fected with CVB3 increased;the inward NCE

6、current decreased,and the reverse p otential of NCE was shifted to negative.AM could inhibit the increase of calcium current,mitigate the inhibition of CVB3 was shifted to negative.AM could inh ibit the increase of calcium current, mitigate the inhibition of CVB3 to inwa rd NCE current and normalize

7、 the negative shifted reverse potential.CONCL USIONS：By counteracting the effects of CVB3 to L-type voltage depend e nt calcium channel and Na/Ca2 exchange, AM could prevent intracellu lar calcium overload and abnormal electric activities caused by virus infection. MeSHAstragalus membranaceus;Coxsac

8、kieviruses;Calcium channels;My ocardium;Rats黄芪(astragalus membranaceus,AM)是一种中医学认为具有补气作用 的中药，因具有调节免疫1-2抗病毒3、清除氧自由基4 和 改善心功能5等作用，近年来被用于病毒性心肌炎的治疗6。细胞内钙 超载是多种原因导致细胞损害的共同途经，病毒感染可引起细胞跨膜钙离子内流增加 7，说明钙离子可能参与病毒介导的细胞损伤。本文利用全细胞膜片钳技术探讨黄芪对 感染柯萨奇B3病毒(CVB3)大鼠心肌细胞L型钙通道(L type voltage dependent calci um channel,LVDC

9、C)、钠离子通道及钠钙交换载体(Na+/Ca2+ exchange,NCE)的效应 ，以了解黄芪对细胞内钙平衡的影响，旨在为临床上应用黄芪治疗心肌炎提供实验依据。材料与方法心肌细胞的分离：用胶原酶灌流法获得SD大鼠单个心室肌细胞8。各 实验组细胞均于37下温育2 h后用于膜片钳记录。温育和贮存在EMEM营养液中进行。实验分组：(1)N：正常对照组。分N1、N2、N3组，分别用LVDCC电流、Na 电流及NCE电流的测量。(2)AM：黄芪对照组。分AM1、AM2、AM3组，相应于N 1、N2、N3组。(3)V：病毒感染组。分为V1、V2、V3组，相应于N1、N 2、N3组。1105mL细胞接种2

10、00TCID50的CVB3。(4）VAM：病 毒感染加黄芪处理组，分VAM1、VAM2、VAM3组，相应于N1、N2、N3组。各组以 最终记录到的细胞数统计。黄芪的用量参照文献7，以EMEM配制 ，其终浓度为0.2 g/mL(黄芪注射液4 g/2 mL，上海福达制药厂，批号941207)。 记录时细胞外液加入同样浓度的黄芪。全细胞膜片钳记录：利用Hamill法9记录全细胞跨膜电 流。将 细胞置于倒置显微镜上盛有台氏液的玻璃凹槽中，自然沉淀35 min，使其贴壁。玻璃微 电极用二步微电极拉制仪拉制(PP-83，Japan）。尖端直径13m，阻抗24M。全 细胞钳制形成后，台氏液转换成相应的测试外

11、液。电压钳制由EPC-9放大器和Macintosh 计算机运行的Pulsepulsefit8.0软件操纵(German,HEKA)。记录LVDCC电流时，保持电压在 -50 mV以灭活T型Ca2通道电流和Na通道电流，测试电压脉冲从-40mV到+60 mV ，步增10 mV，脉宽100 ms，频率0.5Hz。记录Na通道电流时保持电压在-90 mV，测试电 压脉冲从-80 mV到+60 mV，步增10 mV，脉宽20 ms，频率0.5Hz。记录NCE电流时采用斜坡电 压，保持电压在-40 mV，测试电压脉中从-40 mV+60 mV-120 mV-40 mV，速度为180 m V/s。采样结果

12、由计算机自动记录和处理。对于LVDCC电流和Na通道电流以平均膜电 流与膜电容（Cm）比表示其电流密度(Id），单位为pA/pF。对于NCE电流，仅计 算-80 mV和+40mV电压时的膜电流密度Id-80mV与Id40mV，单位为p A/pF；同时记录NCE的逆转电位Vr。溶液制备(mmol/L):(1)测钙电流电极外液：Tetraethylammonium chloride(TEAC l) 135;CaCl2 10；MgCl2 1；HEPES 10；glucose 10;TEAOH调节pH至7.4。(2)测钙钠 电流电极内液：CsCl 120;MgCl2 1；Mg-ATP 4;EGTA 1

13、0;HEPES 10;CsOH调节pH至7.2。(3 )测钠电流电极外液：TEACl 100;NaCl 20;MgCl2 1;glucose 10;HEPES 10;TEAOH调节pH 至7.4。(4)测钠电流电极内液；CsCl 120; NaCl 10;MgCl2 1; Mg-ATP 4;EGTA 10; HEPE S 10;CsOH调节pH至7.2。(5)测NCE电流电极外液：NaCl 140; CaCl2 5; MgCl2 1; Ba Cl2 1；CsCl 2; glucose 10; HEPES 10; ouabain 0.05; verapamil 0.05; NaOH调pH至 7.

14、4。(6)测NCE电流电极内液：CsOH 140; aspartic acid 40; NaCl 20; CaCl2 20；MgC l2 1；TEACl 20; Mg-ATP 8; EGTA40; HEPES 10; CsOH调节pH至7.2。(7)台氏液：NaCl 135; KCl 5.4; CaCl2 2; MgCl2 1； NaH2PO4 0.33；HEPES 5；Glucose 5; N aOH调pH至7.4。结果100 ms内的最大平均钙电流密度在正常对照组、黄芪对照组、病毒感染组和病毒 感染加黄芪处理组分别为(4.130.75) pA/pF (n=23,Cm=26364pF)、(4

15、.040.67) p A/pF(n=14, Cm=29074 pF)、(4.911.4) pA/pF(n=14,Cm=26044pF)和(4.29 0.85) pA/pF(n=12,Cm=30678pF)。最大平均电流 时的去极化电压(Vp)在上述四组分别为(8.37.8、11.03.6、4.93.4、11.77.1) mV 。 黄芪对正常细胞钙电流密度没有明显影响，也不影响Vp;病毒感染后钙电流密度高于正常对 照组(P0.05),Vp趋于降低；黄芪能够抑制CVB3感染所引起的钙电流密度的增加和 Vp的降低。黄芪虽然不改变正常心肌细胞的L型钙通道电流，但黄芪可明显减少L型钙通道电 流幅度随时间

16、的衰减，正常对照组10 min后L型钙通道电流幅度减为初始值的51%12%(n =12),黄芪对照组于10 min后L型钙通道电流的幅度仍有初始值的75%8%(n=8)。正常对照组、黄芪对照组、病毒感染组和病毒感染加黄芪处理组在20 ms内的最大平 均钠电流密度分别为(10.02.7) pA/pF(n=16,Cm=19644pF、7.71.2 pA/pF) (n=10,Cm=21656pF)、(10.02.6) pA/pF (n=12,Cm=19938pF)、(7.81.0) p A/pF(n=10,Cm=25547pF)。各组间无明显差异。正常对照组、黄芪对照组、病毒感染组和病毒感染加黄芪处

17、理组在-80 mV和+40 mV 时的平均钠钙交换电流密度(Id)及钠钙交换载体的逆转电位(Vr)如表1所示。与正 常组相比，黄芪对-80 mV时的内向电流和逆转电位没有影响，却使+40 mV时的外向电流加大 (P0.05);CVB3感染后-80 mV时的内向电流受抑制(P0.05),逆转电位向负 电位偏移(P0.05),对+40 mV时的外向电流没有明显影响；黄芪能够使CVB3感染后 受抑制的内向电流趋于正常和使逆转电位正常化。表1各实验组Cm,Id-80mV，Vr,Id+40 mV的比较Tab 1The Cm,Id?-80 mV,Vr,Id?nCmId-80mVVrId+40mVN1027

18、768AM1129872?V1227668?VAM1023631 *P0.05, vs N group; P0.05, vs AM group讨论心肌细胞膜上的L型电压依赖性钙通道与受体依赖钙通道、钠钙交换载体和钙泵 共同维持着细胞内的钙离子平衡10；L型电压依赖性钙通道在心肌细胞动作电 位形成和触发兴奋收缩偶联过程中也起关键作用。钠钙交换载体于静息期促进细胞内钙离子 降低，动作电位期协同L型电压依赖性钙通道共同触发兴奋收缩偶联。二者功能活性的改变 是细胞产生异常电活动和死亡的原因之一。病毒感染可增加L型电压依赖钙通道的跨膜钙电流，可能与病毒粘附和穿透细胞 膜的过程中，改变了钙通道的空间结构或

19、通过脂质过氧化而影响其磷酸化有关。病毒感染不 仅增加了L型电压依赖性钙通道电流的幅度，也改变了通道的电压依赖性，使最大电流时的 去 极化电压趋于降低；因而病毒感染细胞可于较低的电压下达其峰电流。临床上病毒性心肌炎 患者多合并有早搏等心律失常，可能与病毒对L型钙通道的影响有关。CVB3抑制内向NCE电流，同时使NCE逆转电位向负侧偏移。内向NCE电流是细胞 在静息状态下外运细胞内钙离子，降低细胞内游离钙离子的主要因素。内向NCE电流的抑制 及逆转电位的负移均不利于钙离子的排出，因而于电兴奋期进入细胞内的钙离子静息期不能 有效的排出，细胞内的钙离子逐渐聚积，最终可能导致钙超载。CVB3不影响快Na

20、通 道电流。黄芪不影响正常心肌细胞L型钙通道电流的幅度，但可减缓L型通道电流的衰减 ， 使L型钙通道于较长时间内保持活性，因而具有稳定钙通道的作用。黄芪不影响内向NCE电流 ，却使外向NCE电流增加，从而使动作电位期间由NCE转运入细胞内的钙离子增加。黄芪稳定 L型钙通道和促进外向NCE电流二者皆能增加动作电位期进入细胞内的钙离子，因而可增加心 肌细胞的收缩力，可能此作用即为黄芪的“补气”作用。黄芪对钠通道电流具有轻微的抑制 作用。CVB3感染后，黄芪可抑制病毒感染细胞L型钙通道电流的增加；减轻CVB3对内 向NCE电流的抑制作用，从而使静息期细胞内的钙离子水平降低，促使细胞舒张。黄芪对钠 通

21、道电流的抑制作用也使静息期细胞内的钙离子降低。黄芪降低感染细胞跨膜钙电流的幅度 和拮抗病毒感染对NCE的抑制作用，这可能和黄芪的抗病毒及清除脂质过氧化作用有关。通 过阻止病毒对细胞L型钙通道和钠钙交换载体的影响，黄芪可减少感染细胞可能发生的钙超 载和异常电活动，从而对感染细胞起到保护作用。* 国家九.五攻关基金资助作者单位：刘恭鑫杨英珍郭棋虞勇卫生部病毒性心脏病重点实验室，上海医科大学中山医院 ，上海市心血管病研究所(上海200032)顾全保 中国科学院上海细胞生物学研究所参考文献1Yang YZ,Jin PY,Gu Q, et al.Effectes of astragalus membranac enus on natural killer cell activity and induction of -and -interferon in patients with coxsackie B viral myocarditis.Chin Med J,1990,103:304.2邵启祥，除苏红，夏圣，等.黄芪对小鼠免疫功能的调节作用.中国实验临床免 疫学杂志，1996，8：48.3Pen TQ,Yang YZ,Riesemann H, et al.The inhibitory effect of astragalus membranaceus on coxsakievirus