腐皮镰孢菌壳聚糖酶CSN1的基因克隆、表达及其对致病性影响

1、腐皮镰孢菌壳聚糖酶CSN1的基因克隆、表达及其对致病性影响壳寡糖(Chitooligosaccharides)是由氨基葡萄糖以-1,4-糖苷键缩合而成的低聚物,聚合度一般为220,具有较低的分子量,呈水溶性,易于被细胞吸收,具有多种生物学活性,广泛应用于医药、保健、日化、农业、生防等领域,有着广阔的市场前景,是近年来研究和开发的热点之一壳寡糖主要由壳聚糖(Chitosan)降解产生,而壳聚糖是由自然界中储量最为丰富的含氮类有机化合物甲壳素(Chitin)脱乙酰基形成的。目前壳寡糖的制备方法主要有壳聚糖化学降解法和酶解法。化学法包括浓酸降解法和过氧化氢降解法,但两种方法都较难得到低聚合度的壳寡糖

2、,而且反应条件剧烈,容易引发环境问题。酶解法具有反应条件温和,壳寡糖得率高,不造成环境污染等优点。壳寡糖的酶法制备,又分为复合酶解法和专一性酶解法。复合酶解法是混合利用多种水解酶类,包括纤维素酶,蛋白酶,脂肪酶等,共同降解壳聚糖产生不同聚合度的壳寡糖。而专一性酶解法是利用壳聚糖的专一性水解酶壳聚糖酶(Chitosanase)水解壳聚糖制备壳寡糖的过程。从壳寡糖的转化率、产物分子量分布范围、酶解产品的质量稳定性和酶解过程的可重复性来讲,利用专一性酶解法制备壳寡糖最具有前景和发展优势。壳寡糖市场前景的广阔促使了壳聚糖酶研究的活跃,目前已在多种微生物中分离到了壳聚糖酶,并对其酶学性质、水解机制进行了

3、研究,其中以内切型壳聚糖酶最适合于壳寡糖的生产。酿酒酵母是非常理想的真核生物表达系统,具有原核细菌所没有的真核生物蛋白翻译后修饰加工系统和安全型基因工程受体系统,并能将外源基因表达产物分泌至培养基中,已广泛用于外源基因的表达。酿酒酵母同时也是广泛用于工业生产的经济微生物,具有培养条件简单、生长迅速,便于大规模、高密度发酵,公认的生物安全菌(GRAS),高抗逆性等优良工业生产特性。腐皮镰孢菌(Fusarium solani)在世界范围内分布广泛,可在土壤中长期进行腐生生活,同时也可寄生危害寄主植物。由于其在农业生产上的严重危害,腐皮镰孢菌受到了广泛关注Hadwiger (1980,1981)在研

4、究F. solani与豌豆(Pisum sativum)的相互作用时发现,从F. solani细胞壁上释放出的壳寡糖类能够启动豌豆的防御机制,诱导豌豆细胞植保素(Phytoalexin)的产生,从而提高其抗病性,抑制F. solani的侵染,并通过免疫化学的方法检测到壳寡糖从F. solani细胞壁上释放出来,进入植物细胞中。Prapagdee(2007)研究发现低浓度的外源性壳聚糖类就能够抑制F solani的生长,保护豌豆免于病原真菌引发的猝死综合症(Sudden death syndrome)。鉴于壳聚糖和壳寡糖在病原真菌与植物相互作用中扮演着重要的角色,Shimosaka (1993)

5、曾推测F. solani壳聚糖酶可能与真菌细胞壁的降解或致病性有关,但关于真菌壳聚糖酶生理功能的研究极少,至今尚没有实验性的证据被报道。本实验室前期研究中利用平板透明圈法结合薄层层析法(TLC),筛选到-株能分泌表达壳聚糖酶的腐皮镰孢菌F. solani 0114。对粗酶液的研究表明该菌所产壳聚糖酶的水解产物中不含单糖,水解产物的平均分子量为1.3 kDa,壳寡糖比例较高。本论文的主要研究工作包括：1. F. solani壳聚糖酶基因的克隆及酶学性质研究利用RT-PCR方法扩增得到F. solani 0114壳聚糖酶的cDNA序列,序列分析表明该cDNA中包含一个编码300个氨基酸残基的开放读

6、码框(ORF,903bp)。该序列已提交至GeneBank,登录号为EU263917。将此序列N末端与His标签融合并在大肠杆菌DE3中异源表达,通过对该重组酶的镍柱纯化,透析复性,得到了纯化的壳聚糖酶CSN1。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳显示CSN1的分子量约为30 kDa,酶学性质分析表明CSN1的最适温度为50-,最适pH值为5.6,以脱乙酰度85%的壳聚糖为底物时Km值为0.063 Ing/ml, Vmax为126.58mol/ml.min,比酶活为2.5 Umg。利用薄层层析法(TLC)和高效液相色谱技术(HPLC)对CSN1的酶解产物进行分析,结果表明,水解产物中不含单糖,10糖以下组

7、分占75%以上,为内切型壳聚糖酶。本研究得到的壳聚糖酶CSN1非常适合于壳寡糖的专一性酶解法生产。2. CSN1在酿酒酵母工业菌株中的表达将CSN1的cDNA序列与克鲁维酵母的菊粉酶(INU1A)信号肽序列融合,以实验室前期构建的多拷贝整合性酿酒酵母表达载体pYMIKP质粒为骨架,构建得到CSN1表达质粒pYMIKP-CHO,并将该质粒导入酿酒酵母N-27中,摇瓶发酵实验表明,酿酒酵母重组菌株N-27C所产壳聚糖酶粗酶液的体积酶活达到50.2 mU/ml,成功实现了CSN1在酿酒酵母中的分泌表达,TLC法酶解产物分析表明,重组壳聚糖酶的酶解特性与纯酶及F. solani 0114所产壳聚糖酶相

8、一致。酿酒酵母重组菌株的构建对于CSN1的规模化生产具有潜在的应用价值。3.根瘤农杆菌介导的腐皮镰孢菌转化体系的建立选择两种转化筛选标记：潮酶素B (Hygromycin B)和草丁磷除草剂(PPT)测定其对腐皮镰孢菌孢子生长的最低抑制浓度,结果显示：400gml潮霉素B或750g/ml PPT能够完全抑制F. solani 0114孢子的萌发和生长。以质粒pCAMBIA1300为骨架,构建适合腐皮镰孢菌转化的双元载体pCABAR和pCAHPH,将构建好的质粒转入根瘤农杆菌LBA4404,利用根瘤农杆菌介导的转化技术(ATMT)转化腐皮镰孢菌F. solani 0114。根据前期本实验室对AT

9、MT的研究结果,采用400gml AS,6 h预培养时间处理用于转化的根瘤农杆菌,根瘤农杆菌与腐皮镰孢菌孢子的共培养时间为48小时。并对根瘤农杆菌与真菌孢子比进行优化,结果显示根瘤农杆菌与真菌孢子比为1.0106-ml-1时转化效果较好。测定了两种选择标记：bar和hph对转化效率的影响。结果显示以bar为选择标记时,转化效率为13转化子106孢子；以hph为选择标记时,转化效率为21转化子106孢子。与PEG-CalCl2转化法相比(27转化子107原生质体),ATMT法具有较高的转化效率,而且可以省略繁琐的原生质体制备与再生过程,操作更为简单。ATMT转化体系的建立为下一步的F. sola

10、ni功能基因研究奠定了基础。4.腐皮镰孢菌CSN1超表达菌株和表达下调菌株的构建以质粒pCAMBIA1300为骨架,以勾巢曲霉(Aspergillus nidulans)强组成型启动子gpdA和终止子trpc,构建带有CSN1表达原件的双元载体pCHO。通过ATMT技术将pCHO转入F. solani 0114基因组中,构建超表达CSNl的腐皮镰孢菌。挑取12个阳性克隆进行产酶培养实验,结果表明有5个克隆的壳聚糖酶体积酶活明显增加,最高为出发菌株的2.1倍。根据CSN1 cDNA序列,对其mRNA二级结构进行软件分析,设计出两个能自我配对形成带有544 bp茎和229 nt环结构的发夹片段。以

11、CSN1 cDNA为模板,PCR扩增得到两个片段,将两个片段反向连接,形成反向重复序列(IR)。以质粒pCAMBIA1300为骨架,构建带有IR转录原件的双元载体pCIR,通过ATMT技术将pCIR转入F. solani 0114基因组中,构建得到CSN1的RNA干扰(RNAi)菌株。利用平板透明圈法挑选到5株CSN1表达下调的菌株,Northernblot分析表明5株RNAi转化子胞内的CSN1 mRNA量与出发菌株相比明显降低。5.腐皮镰孢菌壳聚糖酶生理功能研究利用实时荧光定量RT-PCR技术(qRT-PCR)检测到F. solani 0114在液体培养时,CSN1主要在集中在菌体生长的延

12、滞期表达,同时检测到CSN1在F.solani 0114对豌豆不同组织的侵染过程中也有明显表达。表明壳聚糖酶可能不参与菌体的生长过程,而与其致病性有关。对CSN1超表达菌株和RNAi菌株的生长状态,致病能力进行了测定。结果显示,与野生型菌株相比,CSN1超表达菌株在平板和液体培养时的生长都受到了明显的抑制,而RNAi菌株的生长较野生型无明显变化。对三种菌进行豆荚侵染测试,结果显示：与野生型菌株相比,RNAi干涉菌株的侵染能力有明显提高(50%)；而CSN1超表达菌株的侵染能力明显下降(同主题文章1.李风平,何潇,鲍晓明. 壳聚糖酶产生菌的筛选及其酶解产物的初步研究 J. 山东大学学报(理学版)

13、. 2003.(01)2.陈小娥,夏文水,余晓斌. 微生物壳聚糖酶研究进展 J. 海洋科学. 2004.(03)3.王艳,周培根,俞剑,王平平,戚晓玉,陶圣诞. 产壳聚糖酶菌株选育及培养条件优化 J. 中国海洋大学学报(自然科学版). 2005.(02)4.戴芸,朱旭芬. 微生物壳聚糖酶的研究概况 J. 浙江大学学报(农业与生命科学版). 2004.(02)5.邱乐泉,楼坚,潘加林. 壳聚糖酶产生菌的筛选、鉴定及其产酶条件优化 J. 浙江工业大学学报. 2005.(02)6.逄玉娟,韩宝芹,刘万顺,杨菊林. 高产壳聚糖酶菌株的筛选和发酵产酶条件研究 J. 中国海洋大学学报(自然科学版). 2005.(02)7.王艳,周培根,俞剑,王平平,戚晓玉,陶圣诞. 产壳聚糖酶菌株的生物学特性及抑菌性能研究 J. 生物技术. 2004.(05)8.刘怀伟,鲍晓明. 腐皮镰孢菌壳聚糖酶的酶学性质研究及其在酿酒酵母工业菌株中的表达 J