兔局灶脑缺血后内源性阿片肽含量变化

1、    兔局灶脑缺血后内源性阿片肽含量变化        摘要应用兔大脑中动脉阻断(MCAO)局灶脑缺血模型，放免法测定脑组织和血浆中内源性阿片肽(-内啡肽、强啡肽A1-13)的含量。结果发现脑缺血后这两种肽含量均显著增加，且随缺血时间的延长而递增，与脑组织H2O、Na+含量之间呈一定的正相关关系。该结果提示内源性阿片肽可能参与局灶脑缺血脑水肿的发生发展。关键词局灶脑缺血脑水肿-内啡肽强啡肽A1-13 Alterations of contents of endogenous

2、 opioids followingfocal cerebral ischemia in rabbitsBian Liuguan,Luo Qizhong,Zhang Tianxi.Department of Neurosurgery,Renji Hospital,Shanghai SecondMedical University 200001AbstractOn the basis of the model of middle cerebral artery occlusion (MCAO) focal cerebral ischemic model,the endogenous opioid

3、s (-endorphin,-END;Dynorphin A1-13,Dyn A1-13) in plasma and in brain tissue were determined by RIA.We found that the contents of these two neuropeptides were significantly increased and varied much more with the delay of ischemic time.There were positive correlation between the contents of -END,Dyn

4、A1-13and water.The results suggested that the endogenous opioids might take part in the ischemic brain edema.Key wordsFocal cerebral ischemiaCerebral edema-endorphin Dynorphin A1-13神经肽(neuropeptides)与脑缺血的关系近来倍受人们关注，其中尤为突出的是内源性阿片肽。它们广泛分布于中枢神经系统内，除参与痛觉的中枢控制外，还发现它们与中枢神经系统(脑和脊髓)损伤后的继发病理改变有关1，2，但在脑缺血性损伤中

5、的作用报道不多，且存在争议，本文应用兔大脑中动脉阻断(MCAO)局灶脑缺血模型观察脑缺血后-内啡肽(-END)、强啡肽A1-13(Dyn A1-13)两种内源性阿片肽的含量变化，探讨它们在脑缺血脑水肿中的作用。1材料和方法1.1动物分组：健康新西兰白兔48只，雌雄不拘，体重2.53.5kg，随机分成四组：对照组C(正常和假手术对照)、脑缺血后2h、4h、24h组(I2、I4、I24)，分别测定脑组织H2O、Na+(24只兔)及血浆、脑组织-END、Dyn A1-13的含量(24只兔)。1.2建立模型：采用左侧经眶入路电凝阻断大脑中动脉起始部，假手术组仅暴露而不予阻断3。1.3脑组织H2O、Na

6、+含量测定：干湿法测脑组织含H2O率：(湿重-干重)/湿重×100%，干燥脑组织用火焰原子吸收分光光度计(VIDEO IL，22 USA)测定Na+含量(mmol/g干重)。1.4脑组织和血浆-END、Dyn A1-13含量测定标本处理：(1)取对照组、缺血区及对侧相应区域的脑组织称湿重后于生理盐水中煮沸5min，加1当量醋酸匀浆酸化100min后再加等量的1当量NaOH中和，以3000r/min离心15min，取上清液于-40中保存待测。(2)按实验分组采血2ml，加EDTA Na2(1mg/ml)抗凝，其中加抑肽酶(Aprotinin,Sigma,Co)50KIU/ml,4000

7、r/min离心15min，取上清液于-40中保存待测。放免法测-END、Dyn A1-13含量：采用顺序饱和加样法，放免药盒由上海第二军医大学提供，具体操作按药盒说明书。1.5统计学处理：所有数据以±s表示，所有结果用Duncan检验、ANOVA分析及相关回归处理，P<0.05时为差别显著。2结果正常对照、假手术对照及缺血区对侧各变量之间均无显著性差别，故取其均值作为对照组数据。实验发现脑缺血后脑组织和血浆中-END、Dyn A1-13含量显著增加，且随缺血时间的延长而增加。相关回归分析发现脑组织H2O、Na+含量与-END、Dyn A1-13含量之间均呈显著的正相关关系，分别

8、为：r=0.858,P<0.05,r=0.996,P<0.01,r=0.906,P<0.05,r=0.987,P<0.01。表1脑缺血后水、钠的含量变化分组nH2O(%)Na+(mmol/g)C3077.63±0.21233.18±14.52I2678.44±0.27*259.06±19.74*I4679.63±0.34*324.30±19.65*I24681.52±0.24*380.55±40.43*，*示与对照组比较P分别小于0.05,0.01Duncan检验发现缺血组间比较P均小于0.

9、01表2脑缺血后-END、Dyn A1-13的含量变化分组n-ENDDyn A1-13脑组织(pg/mg湿重)血浆(pg/ml)脑组织(pg/mg湿重)血浆(pg/ml)C3011.42±2.5594.49±8.0413.77±1.6234.2±2.79I2623.04±5.75*218.08±44.19*61.22±5.12*65.70±7.06*I4690.25±5.24*279.45±22.10*100.57±23.32*130.12±15.28*I246163.73&

10、#177;39.31*357.85±34.95*174.50±32.96*185.40±29.40*，*示与对照组比较P分别小于0.05，0.01Duncan检验发现缺血组间比较P均小于0.05 3讨论目前认为脑内存在三种内源性阿片肽系统,内啡肽系统，以-END为主要活性物质；还有脑啡肽、强啡肽。这三种肽广泛分布于中枢神经系统内4。本组观察了-END、Dyn两种内啡肽的变化。3.1-END与脑缺血：-END在脑缺血中的作用目前大多认为参与迟发性缺血性损伤，与其影响细胞膜钠泵，钙泵的活性有关。Furui等在鼠MCAO模型中发现：脑缺血脑组织-END含量增加，缺血区脑

11、组织Na+，K+-ATP酶活性降低,应用纳洛酮后酶活性较不用药组明显升高，提示-END可抑制细胞膜的Na+，K+-ATP酶活性5。细胞膜Na+，K+-ATP酶活性对维持细胞内外钠平衡起重要作用，若该酶活性降低则发生细胞毒性脑水肿。我们的实验发现脑缺血后-END含量增加，且与脑组织H2O、Na+含量之间呈显著的正相关。因此，显示了-END参与了脑缺血脑水肿的发生发展。另外，-END还可抑制突触膜Ca2+，Mg2+-ATP酶活性，致细胞内钙超载，继之触发一系列病理反应6。3.2强啡肽与脑缺血：强啡肽前体为强啡肽原，其水解产物中最重要的有强啡肽A1-17、B1-29、A1-8、-新内啡肽，强啡肽A1

12、-17在前强啡肽原作用下转化为强啡肽A1-13。本文检测的强啡肽为DynA1-13。强啡肽在脑缺血中的变化及其作用尚存在争议。刘众等在兔双侧颈总动脉阻断模型中发现脑缺血后和脑脊液中DynA1-13含量显著升高7；但包维丽等在大鼠四血管阻塞模型中发现脑缺血10min再灌注2h后大鼠脑皮质区域强啡肽含量显著降低8；我们的发现与刘众等的发现相似。引起这种差异的原因目前尚不清楚。强啡肽在脑缺血中的作用有报道认为通过活化K受体后具有保护作用。Handa在蒙古沙土鼠单侧颈动脉阻断模型中应用K受体激动剂levellorphin和dynorphin后能明显改善脑缺血后动物的运动功能障碍9；Itoh在鼠短暂脑缺

13、血模型中应用DynA1-1310mg脑室注射后发现脑缺血后学习、记忆障碍显著改善，此作用被K受体拮抗剂norbinaltrophimine所逆转10。但有些研究认为强啡肽参与脑缺血后的病理生理改变。Rozza在兔动脉硬化、颈内动脉注射微球模拟血栓形成的系列研究中发现脑缺血后缺血区K受体数量增加了28%，而受体亲和力不变，他们认为增加的阿片受体为脑缺血和动脉硬化发生的重要生化机制、内源性强啡肽参与了卒中的发生、强啡肽神经元系统的调节变化是血栓和动脉硬化致早期脑血管损伤的一种机制11。我们在本研究中发现脑缺血后强啡肽与脑组织H2O、Na+含量之间呈显著的正相关，提示强啡肽也可能有促进脑缺血脑水肿发

14、生发展的作用。综上所述，有关强啡肽在脑缺血脑损伤中的作用有待进一步研究。作者单位：200001上海第二医科大学仁济医院神经外科（卞留贯罗其中）上海第二医科大学瑞金医院神经外科（张天锡）参 考 文 献1Jiang JY,Zhu C,Cheng CC,et al.Endorphin like immunoreactivity increase in cerebral spinal fluid of acute injuried patients.Neuropeptides 1988,12:177179.2Mchntosh TK,Head VA,Faden AI.Alterations in reg

15、ional concentrations of endogenous opioids following traumatic brain injury in the cats.Brain Res 1987,225133.3赵卫国，张天锡.兔MCAO模型的建立.中国神经精神疾病杂志，1990，16：143145.4卞留贯.神经肽与脑缺血.国外医学脑血管疾病分册，1994，2(增刊)：4750.5Furui T,Tanaka T Iwata K,et al.Alteration in Na+，K+-ATPase activity and -endorphin content in acute is

16、chemic brain with and without naloxone treatment.J Neurosurg 1990,72:458462.6Pillai NP,Rossa DH.Effects of opiates on high affinity Ca2+，Mg2+-ATPase in brain membrane subfraction.J Neurochem 1986,47:16421646.7刘众，史荫绵，陈仁达，等.川芎对急性实验性脑缺血大白兔血浆和脑脊液强啡肽A1-13含量的影响.中西医结合杂志，1990，10：160161.8包维丽，孙凤艳，童杰飞，等.环苯利定对大

17、鼠急性脑缺血的对抗作用.中国药理学报1991，12：348351.9Handa N,Matsumoto M,Kitagawa K,et al.Levallorphin and dynorphin improve motor dysfunction in Mongolian with unilateral carotid occlusion:the first applicatopn of the inclined plane method in the experimental cerebral ischemia.Life Sci 1988,42:182518331.10Itoh J,Ukai M,Kameyama T.Dynorphin A1-13 potently preve