beta-醇溶蛋白编码基因的克隆与序列分析

1、作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2011, 37(8: 14971502/zwxb/ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9E-mail: xbzw 本研究由植物细胞与染色体工程国家重点实验室开放课题(PCCE-2008-KF-02和河南省重大科技专项(0811*资助。*通讯作者(Corresponding authors: 秦广雍, E-mail: qinguangyong; 王道文, E-mail: dwwangReceived(收稿日期: 2011-01-25; Accepted(接受日期: 2011

2、-03-26; Published online(网络出版日期: 2011-06-13. URL: DOI: 10.3724/SP.J.1006.2011.01497普通小麦品种小偃54中/-醇溶蛋白编码基因的克隆与序列分析张晓霞1,2 焦 浈1 董振营2 李世明2 王 燃2 凌宏清2 秦广雍1,* 王道文2,*1郑州大学 / 河南省离子束生物工程重点实验室, 河南郑州 450052; 2中国科学院遗传与发育生物学研究所 / 植物细胞与染色体工程国家重点实验室, 北京 100101摘 要: 醇溶蛋白是小麦籽粒贮藏蛋白的重要组分, 其组成与含量对小麦加工品质具有重要影响。本研究建立了利用PCR

3、从普通小麦基因组BAC 文库中筛选含有/-醇溶蛋白基因序列BAC 克隆的方法, 并获得9个不同的含有/-醇溶蛋白基因的BAC 克隆。从其中鉴定出17个/-醇溶蛋白基因, 其编码区序列长度为852957 bp 。12个序列在编码区内存在提前终止密码子, 推测为假基因。其他5个成员(Gli-Xy54-1、Gli-Xy54-2、Gli-Xy54-3、Gli-Xy54-7和Gli-Xy54-13分别编码291、310、311、287和317个氨基酸残基, 都具有/-醇溶蛋白一级结构的典型特征。根据推导的氨基酸序列中乳糜泻病诱发因子的分布情况及多聚谷氨酰胺重复区的长度差异, 推测Gli-Xy54-7可能

4、定位于6A 染色体, Gli-Xy54-2、Gli-Xy54-3和Gli-Xy54-13可能定位于6B 染色体, Gli-Xy54-1可能定位于6D 染色体。基因聚类分析支持了上述推论。这是第一次从普通小麦中筛选到包含/-醇溶蛋白基因的BAC 克隆, 并从中得到目标基因全长, 对进一步研究普通小麦基因组中/-醇溶蛋白编码基因的组成、表达与功能有较好的参考价值。 关键词: 普通小麦; /-醇溶蛋白; BAC 文库筛选; 基因克隆Cloning and Sequence Analysis of /-gliadin Genes from Common Wheat Va-riety Xiaoyan 5

5、4ZHANG Xiao-Xia 1,2, JIAO Zhen 1, DONG Zhen-Ying 2, LI Shi-Ming 2, WANG Ran 2, LING Hong-Qing 2, QIN Guang-Yong 1,*, and WANG Dao-Wen 2,*1Henan Provincial Key Laboratory of Ion Beam Bioengineering, Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, China; 2 State Key Laboratory of Plant Cell and Chromosome Eng

6、ineering, Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, ChinaAbstract: We developed a method for identifying the genomic BAC clones containing the /-gliadin gene sequences of common wheat (Triticum aestivum L. Using this method, nine unique positive cl

7、ones harboring /-gliadin genes were obtained from the BAC library of the elite wheat variety Xiaoyan 54. From these BAC clones, 17 distinct /-gliadin gene sequences were isolated, 12 of which were pseudogenes because of the presence of one or more premature stop codons in their open reading frame (O

8、RF. The remaining five genes (tentatively designated Gli-Xy54-1, Gli-Xy54-2, Gli-Xy54-3, Gli-Xy54-7, and Gli-Xy54-13 possessed intact ORF. Their deduced protein sequences contained 291, 310, 311, 287, and 317 amino acid residues, respectively, and resembled highly the primary structure of previously

9、 reported /-gliadins. The presence of celiac disease inducing epitopes and the length of the poly-glutamine repeats in the five deduced /-gliadins were analyzed. Based on these data, it was suggested that Gli-Xy54-1 might be located on chromosome 6A, Gli-Xy54-2, Gli-Xy54-3, and Gli-Xy54-13 on chromo

10、some 6B, and Gli-Xy54-7 on chromosome 6D. This proposition was supported by phylogenetic analysis of the gliadin gene sequences isolated here and previously. As far as we know, this work represents the first report on the identification of BAC clones containing the /-gliadin genes from common wheat.

11、 The genes isolated here may facilitate further investigations on the composition, expression and function of /-gliadin genes in common wheat.Keywords: Common wheat; /-gliadin; BAC library screening; Gene cloning1498作物学报第37卷小麦籽粒的加工品质受多种因素影响, 其中籽粒贮藏蛋白的组成和含量起重要作用1。小麦籽粒贮藏蛋白的主要组成成分是麦醇溶蛋白和麦谷蛋白, 其中麦醇溶蛋白约占

12、贮藏蛋白总量的50%60%2。根据酸性(pH 3.1条件下聚丙烯酰胺凝胶电泳迁移率的不同将小麦醇溶蛋白分为-、-、-和-醇溶蛋白, 分别占其总量的25%、30%、30%和15%2。进一步的生化研究及氨基酸序列分析表明, -、-醇溶蛋白为一类, 称/-醇溶蛋白3-5。在面筋复合体中, 麦醇溶蛋白为单聚体, 流动性较大, 对面筋的粘性和延展性的贡献较大6。小麦醇溶蛋白具有高度的异质性和复杂性7-8。编码醇溶蛋白的基因一般成簇分布, 主要存在于6个染色体位点, 即位于第1同源群染色体上的Gli-A1、Gli-B1和Gli-D1以及第6同源群染色体上的Gli-A2、Gli-B2和Gli-D2。Gli-

13、1位点的基因编码所有的-醇溶蛋白和大部分的-醇溶蛋白, Gli-2位点的基因编码所有的-醇溶蛋白、大部分的-醇溶蛋白及部分的-醇溶蛋白9。/-醇溶蛋白肽链一级结构可分为信号肽(1920个氨基酸和250个氨基酸残基的成熟蛋白两部分。成熟蛋白又可分为5个区, 分别为N端重复区、多聚谷氨酰胺I区、特征I 区、多聚谷氨酰胺II区和特征II区10。/-醇溶蛋白分子中的一些结构因子能够诱发严重的乳糜泻病(celiac disease, CD, CD是一种T细胞介导的免疫应答过敏反应, 当乳糜泻易感患者摄入来自燕麦、黑麦和大麦等禾本科作物的醇溶蛋白时, 其特有的多肽刺激病人的敏感T细胞而产生严重慢性腹泻病1

14、1-12, 这些具有致病潜力的多肽统称为乳糜泻病诱发因子(celiac disease epitope。根据乳糜泻病诱发因子的分布以及两个多聚谷氨酰胺区长度情况可以将特定/-醇溶蛋白的编码基因进行染色体定位13。由于/-醇溶蛋白编码基因组成复杂, 目前在普通小麦中还缺乏对这类蛋白编码基因的系统研究。虽然有些研究者已利用PCR方法从普通小麦中分离了多个/醇溶蛋白编码基因, 但还没有通过筛选BAC文库而进一步研究普通小麦醇溶蛋白基因的报道。本研究旨在筛选含有/-醇溶蛋白编码基因的BAC克隆, 并进一步鉴定出每个阳性BAC克隆中含有的/-醇溶蛋白编码基因的种类, 为深入研究普通小麦基因组中/-醇溶蛋

15、白编码基因的组成、表达与功能奠定基础。1材料与方法1.1植物材料及其BAC文库普通小麦(Triticum aestivum L.品种小偃54和中国春由中国科学院遗传与发育生物学研究所植物细胞与染色体工程国家重点实验室保存, 参照Lee等14的方法进行基因组DNA样品提取。小偃54基因组BAC文库由中国科学院遗传与发育生物学研究所凌宏清课题组提供, 该BAC文库共含有937 920个克隆, 覆盖小麦基因组的4.5倍, 平均插入片段为82 kb15。按Dong等15的方法进行BAC质粒提取。1.2小偃54基因组BAC文库筛选根据NCBI数据库(/

16、中的/-醇溶蛋白基因序列设计了1对覆盖/-醇溶蛋白基因开放阅读框的保守引物(GliF1: 5-ATGAAGACCTTTC TCATCCTTG-3, GliR1: 5-TCAGTTGGTACCGAAGAT GC-3, 其扩增产物为/-醇溶蛋白基因的全长编码区。PCR 反应总体积为16 L, 含10× PCR buffer 1.6 L、dNTP 0.3 L、引物各0.12 L、Taq DNA聚合酶0.12 L、质粒DNA 1 L、双蒸水12.74 L。PCR反应条件为94预变性5 min; 94变性30 s, 60退火30 s, 72延伸45 s, 34个循环; 72 延伸10 min。

17、用1%琼脂糖凝胶在1 × TAE 缓冲液中电泳分离PCR 产物。按Dong等15的方法利用PCR试验筛选上述BAC文库。1.3 BAC克隆中醇溶蛋白编码基因序列的获取与测序利用保守引物GliF1/GliR1从BAC单克隆中获取醇溶蛋白基因的PCR扩增产物并连接到pGEM-T easy (Promega, USA载体上。为便于PCR产物的分析, 设计跨多聚谷氨酰胺I区编码区的第二对醇溶蛋白基因保守性片段分析引物(GliF2: 5-TTAGAGTTCCAGTGCCACA A-3, GliR2: 5-CATGCTATTATTCTGCATCAAC-3, 并对GliF2进行FAM荧光标记 (T

18、aKaRa, 辽宁大连。利用ABI 3730遗传分析仪(Applied Biosystems, Foster City, CA的毛细管电泳功能对荧光标记的PCR片段检测分类, 从长度不同的阳性TA克隆中每个挑选3个重复由上海英骏生物技术有限公司测序。1.4 测序结果及序列分析用DNAMAN version 5.2.2 (Lynnon Biosoft, Quebec, Canada分析醇溶蛋白基因序列。利用推导的氨基酸序列在NCBI数据库中进行Blastp搜索获得同源序列, 选取普通小麦及其近缘物种的/-醇溶蛋白氨基酸序列进行序列比对分析(http:/www.ebi.ac.uk/Tools/cl

19、ustalw2/index. html, 最后用MEGA4.016构建进化树。2结果与分析2.1 BAC文库筛选与/-醇溶蛋白基因的克隆以小偃54基因组DNA样品为模板, GliF1/GliR1为引物, 获得约900 bp的扩增产物(图1, 与/-醇溶蛋白编码基因全长的预期结果17-18一致。测序结果表明, 该片段与已发表的/-醇溶蛋白基因高度相似, 因此确定引物GliF1和GliR1对/-醇溶蛋白基因序列具有特异性。利用GliF1/GliR1引物在小偃54的BAC文库中筛选到9个阳性BAC克隆(图1。利用GliF2/GliR2引物扩增每个阳性BAC克隆中含有的醇溶蛋白基因成员的序列, 扩增片

20、段的长度多态性分析结合目标片段的DNA序列, 共鉴定出17个独特的片段, 代表17个不同的醇溶蛋白基因, 暂命名为Gli-Xy54-1到Gli-Xy54-17。利用GliF1/GliR1扩增及PCR产物克隆, 获得了这17个基因的全长编码区第8期张晓霞等: 普通小麦品种小偃54中/-醇溶蛋白编码基因的克隆与序列分析1499序列, 其长度为852957 bp。 图1引物GliF1和GliR1以小偃54基因组DNA及9个阳性BAC 克隆为模板的PCR扩增产物(1.0%琼脂糖凝胶电泳Fig. 1 PCR products amplified from the genomic DNA sample o

21、f Xiaoyan 54 and nine positive BAC clones (1.0% agarose gel elec-trophoresisM: Trans2K plus DNA marker; 1:小偃54; 210: 9 个阳性BAC克隆。M: Trans2K plus DNA marker; 1: Xiaoyan 54; 210: 9 positive BACclones.2.2 /-醇溶蛋白序列结构分析核苷酸序列比对表明从小偃54中得到的17个基因成员之间相似性较高, 相似性最高为97.3%, 差异主要集中在两个多聚谷氨酰胺区的编码序列。与数据库中的同源序列比对发现, 它们

22、与来源于普通小麦、一粒小麦、野生二粒小麦和硬粒小麦的/-醇溶蛋白基因序列高度相似, 最高达99.9%, 而与-醇溶蛋白、-醇溶蛋白差异明显, 相似度为仅50%左右。生物信息学分析表明, 在获得的17个/-醇溶蛋白基因中, 12个成员为假基因, 比例为70.6%。12个假基因中出现的提前终止密码子共21个, 其中10个出现于特征II区, 5个出现于N端重复区, 3个出现于多聚谷氨酰胺I 区, 2个出现于多聚谷氨酰胺II区, 1个出现于特征I区。提前终止密码子的产生均为单碱基替换所致, 其中20个的C被T替换, 导致编码谷氨酰胺(Q的密码子CAA/CAG 转变为终止密码子TAA/TAG; 1个的T

23、被A替换, 导致编码赖氨酸(L的密码子TTG转变为终止密码子TAG。另外5个/-醇溶蛋白基因(Gli-Xy54-1、Gli-Xy54-2、Gli-Xy54- 3、Gli-Xy54-7和Gli-Xy54-13具有完整的编码框, 分别编码291、310、311、287和317个氨基酸残基。将5个基因推导的氨基酸序列和GenBank数据库中/-醇溶蛋白的氨基酸序列进行比对分析, 5个多肽序列与已知的/-醇溶蛋白序列都具有/-醇溶蛋白的典型特征, 含有20个氨基酸组成的信号肽(MKTFLILALLAIV ATTATTA、N端重复区、多聚谷氨酰胺I区、特征I区、多聚谷胺酰胺II区和特征II区。序列比对表

24、明信号肽、特征I区和特征II区具有很强的保守性, 不同蛋白间的差异主要集中在两个多聚谷氨酰胺区和重复区(图2。在5个推导的/-醇溶蛋白序列中, N端重复区的氨基酸数为95 (Gli-Xy54-1和Gli-xy54-7或100 (Gli-Xy54- 2、Gli-Xy54-3和Gli-Xy54-13两种, 在该区具有一致的重复单元PQPQPFP和PQQPY。另外发现有多个单碱基突变, 主要导致脯氨酸(P和亮氨酸(L、脯氨酸(P和谷氨酰胺(Q、脯氨酸(P和精氨酸(R以及脯氨酸(P和丝氨酸(S之间的互变。大多数/-醇溶蛋白在特征区有6个保守的半胱氨酸残基(C, 其中4个位于特征I区, 2个位于特征II

25、区6,19。本研究获得的5个/-醇溶蛋白序列在特征区均有6个保守的半胱氨酸残基(C, 且4个位于特征I区, 2个位于特征II区, 未发现有额外半胱氨酸残基(C的出现或保守半胱氨酸残基(C被替换。2个多聚谷氨酰胺区的存在是醇溶蛋白不同于其他谷蛋白的特征之一, 其氨基酸组成几乎全部为谷氨酰胺残基。谷氨酰胺残基的数目在不同的/-醇溶蛋白间变化较大, 这也通常是决定醇溶蛋白大小的主要因素。比较Gli-Xy54-1、Gli-Xy54-2、Gli-Xy54-3、Gli-Xy54-7和Gli-Xy54-13与其他醇溶蛋白的多聚谷氨酰胺区发现, 在多聚谷氨酰胺I区, 主要是谷氨酰胺(Q数量的变化, 其中Gli

26、-Xy54-2、Gli-Xy54-3和Gli-Xy54-13的第4位均由谷氨酰胺(Q突变为丙氨酸(A。而多聚谷氨酰胺II区在氨基酸残基的数量和种类上均有较大变化, 出现了多个非谷氨酰胺残基, 其中Gli-Xy54-1的第3、第4、第5、第6位均由谷氨酰胺(Q突变为组氨酸(H; Gli-Xy54-2、Gli-Xy54-3和Gli-Xy54-13的第8位均由由谷氨酰胺(Q突变为谷氨酸(E, 第13和第21位均由谷氨酰胺(Q突变为亮氨酸(L, 第25位均由谷氨酰胺(Q突变为精氨酸(R, 另外Gli-Xy54-2和Gli-Xy54-3的第22位均由谷氨酰胺(Q突变为组氨酸(H(图2。2.3 /-醇溶蛋

27、白中乳糜泻病诱发因子的分析已发现不同/-醇溶蛋白中主要存在4种乳糜泻病诱发因子, 即Gli- (QGSFQPSQQ、Gli-2 (PQPQL PYPQ、Gli-9 (PFPQPQLPY和Gli-20 (FRPPQQP YPQ 13,20。在来源于不同基因组的/-醇溶蛋白之间, 该4种乳糜泻病诱发因子的分布以及2个多聚谷氨酰胺区的平均长度有明显的差异。一般情况下, 来源于A基因组的/-醇溶蛋白含有Gli-9和Gli-20 2种诱发因子, 而没有完整的Gli-和Gli-2, 且其多聚谷氨酰胺I区平均长度最长; 由B基因组编码的/-醇溶蛋白不含这4种乳糜泻病诱发因子中的任意一种, 且其多聚谷氨酰胺I

28、I区平均长度最长; 而由D基因组编码的/-醇溶蛋白常含有14种乳糜泻病诱发因子。据此, 我们将来自小偃54的5个/-醇溶蛋白基因初步定位, 推测Gli-Xy54-7可能定位于6A染色体, Gli-Xy54-2、Gli-Xy54-3和Gli- Xy54-13可能来源于6B染色体, Gli-Xy54-1可能来源于6D 染色体(表1。2.4 /-醇溶蛋白基因的聚类分析同源性分析表明, 16个/-醇溶蛋白聚为一大类, 其中本研究克隆到的Gli-Xy54-7与来自A染色体组的/-醇溶蛋白序列(DQ002572、DQ002570、AAZ73728和DQ401696聚为一小支; Gli-Xy54-2、Gli

29、-Xy54-3和Gli-Xy54-13与来自B染色体组的/-醇溶蛋白序列(AAA96522、AAA34275和P04725聚为一小支; Gli-Xy54- 1与来自D染色体组的/-醇溶蛋白序列(ABQ52112、ABQ52114、ADM96163和DQ002595聚为一小支。31500作 物 学 报 第37卷 图2 从小偃54中分离的5个/-醇溶蛋白基因推导的氨基酸序列与其他11个已知序列的比对Fig. 2 Alignment of the deduced amino acid sequences from five /-gliadin genes cloned in this work an

30、d other eleven known genes pre-viously isolated from common wheat or related species表1 来自小偃54的5个/-醇溶蛋白中具有的乳糜泻病诱发因子的数量及2个多聚谷氨酰胺区的氨基酸残基数Table 1 Celiac disease inducing epitopes and the numbers of amino acid residues in the two polyglutamine domains of the four /-gliadinsfrom Xiaoyan 54/-醇溶蛋白 /-gliadin

31、Gli -9 Gli -20 Gli - Gli -2多聚谷氨酰胺I 区 Polyglutamine domain I多聚谷氨酰胺II 区 Polyglutamine domain IIGli-Xy54-1 1 1 0 1 15 16 Gli-Xy54-2 0 0 0 0 16 27 Gli-Xy54-3 0 0 0 0 17 27 Gli-Xy54-7 1 1 0 0 19 8 Gli-Xy54-13 0 0 0 02327第8期张晓霞等: 普通小麦品种小偃54中/-醇溶蛋白编码基因的克隆与序列分析1501个-醇溶蛋白序列和3个-醇溶蛋白序列分别聚为另外2个独立的类群(图3。该聚类分析结果与

32、上述依据乳糜泻诱病因子分布及2个多聚谷氨酰胺区长度对Gli-Xy54-1、Gli-Xy54-2、Gli-Xy54-3、Gli-Xy54-7和Gli-Xy54-13的染色体定位结果一致。 图3醇溶蛋白基因的聚类分析Fig. 3 Phylogenetic analysis of gliadin genes3讨论虽然前人发现醇溶蛋白对小麦加工品质有较大影响, 但关于普通小麦醇溶蛋白基因的系统研究甚少。本研究建立了利用PCR从普通小麦基因组BAC文库中筛选含有/-醇溶蛋白基因序列BAC克隆的有效方法, 首次从优质小麦品种小偃54中鉴定出了9个阳性BAC克隆, 旨在为将来系统研究/-醇溶蛋白的基因组成、

33、表达与功能奠定基础。我们从9个BAC克隆中鉴定出了17个不同的/-醇溶蛋白基因。由于普通小麦基因组的高度复杂性, 我们所筛选到的9个BAC克隆是否包含所有的/-醇溶蛋白编码基因尚待进一步研究。/-醇溶蛋白基因的拷贝数在不同小麦品种和祖先种中有较大差异, 其拷贝数从25到150不等21-23。Anderson等21认为, /-醇溶蛋白基因中有较大比例的假基因, 约50%左右。Van Herpen等13研究发现, 部分二倍体小麦中/-醇溶蛋白基因序列中约87%的序列为假基因, 进一步支持了上述观点。本研究在小偃54中共克隆到17条/-醇溶蛋白基因序列, 其中有12条序列为假基因, 假基因比例为70

34、.6%。较高数量的/-醇溶蛋白假基因可能在多倍体小麦形成之前就已经存在于二倍体物种中24。Anderson等21认为由于/-醇溶蛋白基因具有丰富的谷氨酰胺密码子CAA和CAG, 而C-T替换产生提前终止密码子可能是导致/-醇溶蛋白基因序列中假基因比例高的一个主要原因。本研究发现导致假基因出现的提前终止密码子中95%是此种单碱基突变所致, 支持了Anderson等21关于/-醇溶蛋白假基因编码区中提前终止密码子产生原因的推测。Van Herpen等13研究了230个二倍体小麦的/-醇溶蛋白基因, 发现Gli-9、Gli-20、Gli-和Gli-2这4种乳糜泻病诱发因子的分布和两个多聚谷氨酰胺重复

35、区的平均长度在不同基因组间有明显差异。朱西平等25根据推导氨基酸序列所具有的4种乳糜泻病诱发因子、多聚谷氨酰胺重复区的长度及相似性分析, 对普通小麦品种中克隆的/-醇溶蛋白基因进行了染色体定位, 并用中国春缺体-四体系对该染色体定位方法进行了验证。本研究发现Gli-Xy54-1、Gli-Xy54-2、Gli-Xy54-3、Gli-Xy54-7和Gli-Xy54-13推导的氨基酸序列间在乳糜泻病诱发因子分布方面具有明显差异, 2个多聚谷氨酰胺区的长度亦有明显不同。据此我们推测Gli-Xy54-7来源于6A染色体; Gli-Xy54-2、Gli-Xy54-3和Gli-Xy54-13来源于6B染色体

36、; Gli-Xy54-1来源于6D染色体。后继的聚类分析也与此推测的染色体定位结果一致。在我们克隆到的5个具有完整编码框的/-醇溶蛋白基因中, Gli-Xy54-2、Gli-Xy54-3和Gli-Xy54-13的推导氨基酸序列不含4种乳糜泻病诱发因子(Gli-、Gli-2、Gli-9和Gli-20中的任意一种, 这3个基因在未来培育有益于人类健康的小麦品种中可能有重要利用价值。致谢:对中国科学院遗传与发育生物学研究所植物细胞与染色体工程国家重点实验室樊华杰、李斌、秦焕菊、刘昕和刘坤凡在实验材料的准备、实验技术的指导及实验试剂订购方面的帮助表示衷心的感谢。References1 Han B(韩彬

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