多层软骨组织工程支架的制备

1、26卷 4期 2007年 8月中 国 生 物 医 学 工 程 学 报Chinese Journal o f Biomedical Engineering V ol. 26 N o. 4August 2007收稿日期 :2005212205, 修回日期 :2007205222。基金项目 :国家自然科学基金资助项目 (50403023 , 广东省自然科学基金资助项目 (4205786 。 3通讯作者。 E 2mail :im wugang . cn多层软骨组织工程支架的制备吴 刚 3 王迎军 陈晓峰 叶建东 宁成云 赵娜如 任 力(华南理工大学特种功能材料教育部重点实验室 , 广州

2、 510640摘 要 :软骨组织工程为关节软骨损伤的治疗提供了一种理想的治疗途径 , 但体外构建的软骨如何在临床应用时 采用适当的方法短期内在体内进行良好地固定仍然没有得到很好的解决 , 阻碍了采用组织工程方法治疗关节软骨 疾病的临床应用 。 本研究通过冷冻干燥的方法制备出一个上层为胶原 , 一体化软骨组织工程支架 , , 到对上层软骨进行固定的目的 。 架内部的分布 ;SE M 程支架 , , , 。为软骨组织工 关键词 :; 支架 ; 固定F abrication of Layered Scaffold for C artilage Tissue E ngineeringW U G ang

3、 3 W ANG Y ing 2Jun CHE N X iao 2Feng YE Jian 2D ong NING Cheng 2Y un ZH AO Na 2Ru RE N Li(K ey Laboratory o f Specially Functional Materials , Ministry o f Education , South China Univer sity o f Technology , Guangzhou 510640Abstract :Cartilage tissue engineering is a prom ising therapy for articul

4、ar cartilage lesions. But the problem how to quickly fix the constructed cartilage tissue in vitro to the natural tissue is still under research. This w ould in fluence the w ide application of cartilage tissue engineering production in clinical practice. In this study , a layered articular cartilag

5、e tissue engineering scaffold was made by the freeze 2dry method. The upm ost layer is a pure collagen layer and the downm ost layer is a collagen hydroxyapatite (H A com posite layer. Between the tw o layers are the layers that the H A contents increased. This structure w ith the H A contents has t

6、he osteoconduction capacity , and makes it possible to achieve the fast fixation function of the engineered cartilage through the interaction between the bone and the H A contents in the scaffold once the scaffold im planted into the tissue. The fabrication method and the structure properties of the

7、 layered scaffold were discussed in this paper. The results showed that the pore size and porosity of the collagen layer could be controlled by the frozen tem perature and the collagen solution concentration. The H A particle size and distribution of it w ould in fluence H A s distribution in the co

8、llagen scaffold. SE M pictures showed that the fabricated layered collagen H A com posite scaffold was a 6cm cylinder w ith three different H A content containing layers. Each layer had a height about 2cm. The three layers formed a hom ogeneous unit w ithout any separation between each layer. The la

9、yered scaffold could be a prom ising candidate for the cartilage tissue engineering. K ey w ords :tissueengineering cartilage ; scaffold ; anchoring中图分类号 R318108 文献标识码 A 文章编号 025828021(2007 0420612206引言关节软骨损伤是骨科临床的常见疾病 。 临床对 关节软骨损伤治疗的手段不多 , 效果也不太理想 1。 目前对损伤关节软骨的治疗方法主要有两类 :刺激 关节软骨自身修复和组织细胞移植 2-4。这些方法

10、 能减轻症状 , 改善关节功能 , 而且能形成透明样软骨 修复组织 , 但形成的透明样软骨不是正常关节软骨 , 其功能及耐用性缺乏长期效果观察 。组织工程化软骨为病损软骨组织治疗提供了一 种新的途径 5-7。 但体外培养软骨在体内的固定是 一个需要解决的重要问题 。 采用手术固定移植物的 方法 , 操作困难 , 耗时长 , , 关节面光滑 , , 。, 容易导致 受损伤部位组织细胞死亡 。 采用生物粘合剂由于生 物制品容易感染或传染各种疾病并受来源的限制 , 且其粘合强度也难以令人满意 8。目前有一些通过采用组织工程支架的方式来对 软骨结构进行体内固定的研究报道 。 如在支架上层 部分构建软骨

11、组织 , 再植入体内 , 利用支架下层同骨 组织的结合 , 解决软骨的体内固定的问题 9。这种 支架往往单独采用高分子 , 或采用钙磷盐材料 , 由于 软骨和骨对生长环境的不同特点 , 单一支架难以同 时很好地满足软骨和成骨细胞的生长要求 10-12。 采用复合支架的方式 , 如采用多孔生物陶瓷上吸附 一层天然高分子 , 但吸附上的高分子结合强度不高 , 过度不连续 , 容易分层 , 影响细胞的生长迁移及固定 效果 13-15。本研究采用了一体复合支架结构 。 该支架上层 为生物相容性能良好的胶原层 , 可连续过渡到采用 以羟基磷灰石为主的下层 , 过渡层完全结合在一起 形成一个整体 , 避免

12、了以往支架体系存在物理界面 的缺点 。 胶原是软骨细胞理想的支架材料 , 而羟基 磷灰石对骨细胞及组织有天然的亲和性 , 利于支架 植入体内后骨组织快速同支架结合 , 达到固定上层 软骨组织的目的 , 从而在一定程度上解决了软骨固 定的问题 。 本研究对实现这种支架结构的工艺方法 进行了初步的探索 , 实验结果证明通过本研究中采 用的方法能够制备出具有这种结构特征的支架 。1 材料和方法111 材料 型胶原溶液 (广州市创尔生物技术有限公司 , 浓度 6mg m L ,Ca (NO32和 (NH 4 2HPO 4(分析纯 , 天 津化学试剂厂 ,12乙基 232(32二甲基氨丙基 碳二亚 氨

13、(E DC ,10%水溶液 , 吉尔生化有限公司 。112 方法11211 羟基磷灰石 (H A 合成主要步骤为在室温和 pH =111512的条件下 ,将 (NH42HPO 4溶液滴加到 Ca (NO 3 2溶液中 , 常温 反应 24h , 沉淀 24h 后再用去离子水反复沉淀物至中 性 , 干燥 、 研磨 、 过筛 、 1100 16。 1121, 最上层为纯胶原溶 液 。 放入 4 冰箱中 24h 后 , 再放入低温冰箱中冷 冻 1h 脱模 , 冷冻干燥 12h , 得到圆柱型组织工程支 架 。11213 测试方法用 XRD (X pert Pro , PANlytical , Net

14、herland 对合 成的 H A 粉 末 纯 度 进 行 分 析 。用 激 光 粒 度 仪 (H oriba , L920, Japan 分析 H A 粉体的粒度分布 。 样 品用液氮脆断后 , 断面喷金 , 在 SE M (Philips X L 230 上观察材料断面形貌 。2 结果与讨论211 羟基磷灰石的复合XRD 图 (图 1 测试结果证实了本研究制备的 H A 粉具有较高的纯度 , 因此保证其良好的生物活 性 。 H A 的化学成分与骨组织中无机矿物的成分相 似 。 有大量的研究表明 H A 生物相容性良好 , 且具 有良好的骨传导性能 。 H A 是本研究方案中保证支 架底部能

15、够与骨形成快速结合的重要因素 。 图 1中 的胶原与 H A 的比例为 1 1,XRD 图显示胶原和 H A 都表现出了各自的特征吸收峰 , 表明复合工艺对二 种材料的结构没有影响 , 保证了二种组分在组织工 程支架中发挥各自的作用 。212 层状支架的结构图 2是采用各 200微升的纯胶原 ,1 1和 1 3的 胶原 H A 复合溶液 , 利用实验步骤中提到的一体化 支架的制备方法制备出的具有三层结构的胶原 H A 复合多孔支架 。 图 2(a 是支架整体的照片 , 从图中 可以看出一体化支架各层之间紧密的结合在一起 , 没有界面存在 , 支架直径约为 6mm , 高度约为 6mm , 各层

16、的高度约为 2mm 。 图 2(b 是图 2(a 中不同 H A 3164期 吴刚等 :多层软骨组织工程支架的制备图 1 H A 粉 、 胶原以及胶原 H A 复合材料 XR D 图谱 Fig. 1 XR D p atterns of H A , collagen and collagen H A 含量层间的过渡部分的放大 , 从 SE M 中可以明显看 出 H A c 2(a 过渡 , SE M 2a 、 (b 、 (c , 在支架的成分 上存在一个 H A 含量递增的结构 , 但在支架的空间 物理结构上不存在类似粘合或叠加的这样一个过渡 结构 , 从而避免了以往由于存在自然界面导致的软 骨

17、与软骨下骨结合难的问题 。由于支架从胶原层到复合 H A 的复合结构层形 成了整体的结构 , 在保证胶原层上关节软骨良好生 长环境构建的同时 , 做到了支架下部能够快速地与 周围骨组织结合 , 起到固定上部软骨的目的 。同时 支架下部的结构能使促进软骨下骨在支架上的生长 增殖 , 促进软骨下骨的生长 , 从而从整体上保证了关 节软骨能够在一个理想的生理及力学环境中进行增 殖 、 分化 , 从而更好地促进关节软骨的生长 。本研究中所采用的制备方法能够通过对不同结 构层的加入比例的调控调节各层的厚度 , 并且能够 通过在各层溶液中加入各种成分 , 如具有缓释功能 的微球 , 对各层的成分进行良好的

18、控制 , 以达到制备 理想软骨层状组织工程支架的目的 。213 胶原层结构图 3是采用不同预处理温度及不同胶原溶液浓 度制备的复合支架上的纯胶原层结构的 SE M 照片 , 从中可以看出的胶原支架具有较高的孔隙连通率 , 这种结构利于在组织培养时细胞的物质代谢 , 同时 利于在植入体内后血管快速长入支架内部 , 避免植 入后初期仅通过简单的物质扩散而导致的细胞代谢 时营养物质供应不足造成细胞死亡 , 导致植入失败 。 从图中也可以看出随预处理温度的升高及胶原浓度 的降低支架的孔径随之变大 , 支架的孔结构是可以 通过工艺参数的控制来进行调控的 。图 2 层状胶原 H A 复合支架的 SEM 照

19、片 。 (a 支架整 体结构 ;(b 不同 H A 含量层的过渡 ;(c 纯胶原向含 H A 部分层的过渡Fig. 2 SEM of layered Collagen H A scaffold. (a bulk structure of the scaffold; (b connection zone of different H A content layer ; (c connection zone of pure collagen layer and collagen H A layer胶原材料由于其特殊的理化性质 , 往往只能采 用冷冻干燥的成型方法来制备多孔材料 , 支架的孔 隙是通

20、过低温时溶剂冰晶升华后留下的空穴形成 , 低浓度及高预冷冻温度均可使冰晶更大 。 因此可以 通过对相关温度 、 时间以及浓度的控制 , 制得需要孔416中 国 生 物 医 学 工 程 学 报 26卷 图 3 胶原三维支架 SEM 照片 (制备条件 :(a -25 , 6mg m L ;(b -85 ,6mg m L ; (c -85 ,1mg m LFig. 3 SEM of pure collagen layer(fabrication condition : (a -25 , 6mg m L ; (b -85 , 6mg m L ; (c -85 , 1mg m L径的三维支架 , 以满足

21、临床应用的要求 。使用浓度和粘度低的胶原溶液较利于 H A 在其 中的分散 , 但浓度降低后在制备相同体积的支架材 料时可导致成型性能下降 。 在对 H A 的分散性能及 胶原支架的成型性能的兼顾上 , 本研究采用了 6mg m L 的胶原溶液 。214 HA 在胶原中的复合分布结构H A 的粒度大小及分布对其在胶原中的分散影 响较大 , 细颗粒不易分散 , 且不同粒径的颗粒在胶原 支架中的分散方式有所不同 (图 5(a , H A 的粒度 越小 , 其比表面积越大 , 能够提供更多的接触面积 , 提高生物活性 , 但粒度太小容易团聚 。而颗粒较大 的 H A 颗粒能够填充在支架的孔隙内 ,

22、起到支撑胶 原支架的目的 , 在一定程度上提高了胶原 H A 复合 支架的力学强度 。同样 , H A 的粒度大小及分布对 H A 的降解性能 、 生物学性能也有重要的影响 , 应综 合考虑 H A 的粒度大小 、 , 促进软骨, , 避免 A , 影响软骨下骨的再生建 。 本研究采用的 H A 的粒度经激光粒度仪的测试 表明在 013200m 之间 , 平均粒径约为 38m (图 4 。图 4 H A 粉体粒度分布图Fig. 4 P article distribution of H A powders图 5是采用 6g L 的胶原浓度为基础复合不同 比例的 H A , 采用 -60 进行预

23、冷冻 , 再通过冷冻干 燥的方法成型制备出的 H A 在胶原支架中分散的 SE M 照片 。 图 5(a 是胶原与 H A 复合比例为 1:1时 的 SE M 照片 , 从图中可以看到胶原仍然保持多孔支 架的结构 , 未团聚的 H A 小颗粒分布在胶原基质形 成的孔壁上 , 部分团聚的 H A 填充了胶原支架的孔 隙 , 大颗粒的 H A 粉体直接填充在支架的孔隙内部 。 图 5(b 显示胶原与 H A 复合比例为 1 3时 , 胶原仍 然可以形成连续性支架 , 但 H A 大量填充了胶原支 架的孔隙 , 严重影响了复合支架的多孔结构的形成 。 图 5(c 是胶原与 H A 复合比例为 1 6

24、时的复合支架 的 SE M 照片 , 此时几乎难以形成多孔的支架结构 , 复合支架以 H A 为主体 , H A 粉体形成堆积的结构 , 胶原散在分布在 H A 之间 , 起到类似对 H A 进行粘结 的效果 。5164期 吴刚等 :多层软骨组织工程支架的制备 图 5 羟基磷灰石在胶原中分散的 SEM 照片 (胶原与 H A 比例 :(a 1 1;(b 1 3;(c 1 6Fig. 5 SEM of H A distributed in different layer (ratio of collagen and H A :(a 1 1;(b 1 3;(c 1 6H A 在支架内的分布特性对多孔材料的力学性 能有影响 , 团聚以及大颗粒的 H A 粉体通过填充孔 隙起到对支架的增强作用 。粉体的用量 、 粒度及其 分布也会对材料的力学性能产生不同的影响 , 选择 适当的 H A 的粒度分布及含量能够在一定