多药耐药相关蛋白在人肝细胞癌亚群细胞中的表达及意义

1、多药耐药相关蛋白在人肝细胞癌亚群细胞中的表达及意义         【摘要】  目的 检测肝细胞癌异质性亚群细胞对化疗药物的耐药差异，探讨耐药蛋白在肝癌组织中不同亚群细胞的表达意义。方法 通过MTT法分别测定人肝细胞癌异质性亚群细胞在不同浓度、不同化疗药物（ADM、VP-16、DDP）作用下的抑制率，计算每种药物IC50值。 应用流式细胞仪分别检测耐药相关蛋白MDR1、MRP、LRP、GST在两亚群细胞中的表达率。结果 LCSC-1和LCSC-2亚群细胞对阿霉素（ADM）、顺铂（DDP）、鬼臼乙叉苷(VP

2、-16)等药物都产生了耐药性（F249.651）。三种药物对LCSC-2亚群细胞和LCSC-1亚群细胞抑制率有显着差异 (P0 .01)。LCSC-1和LCSC-1亚群细胞MDR1、MRP、LRP、GST的表达量分别是：（23.97± 0.34）% 、（17.03±0.59）% 、（24.02±0.63）% 、（23.93± 0.59）% ；（26.59± 0.78）% 、（19.43± 0.60）% 、（26.43±1.06）% 、（26.24±1.06）% ；两亚群比较，t=5.32 ，P=0.006；t=4.

3、94 ，P=0.008；t=3.85，P=0.028；t=3.30，P=0.030。两亚群细胞MDR1、MRP、LRP、GST的表达有显着性差异。结论 MRP、LRP、GST、MDR1的高表达，可能是人肝癌细胞异质性亚群多耐药产生的部分分子基础，耐药是肝细胞癌干细胞的特征之一。 【关键词】  肝细胞癌 异质性亚群细胞 多药耐药   Key words  Hepatocellular carcinomas  Heterogeneous subpopulations cells  Multiple drug resistance 

4、;  肿瘤细胞对细胞毒药物的耐药是影响肿瘤病人化疗疗效的一个重要因素， 人类多药耐药（multi-drug resistance，MDR）基因及其基因产物在肿瘤的多药耐药性中起着重要作用3。我们通过原代肝细胞癌细胞培养，克隆分离出了两种不同形态、不同生物学特性及不同成瘤能力的肝细胞癌亚群细胞。本研究通过检测化疗药物对这两种亚群细胞生长的抑制程度及多耐药基因在两种亚群细胞中的表达水平，来探讨HCC 组织中MDR基因表达与肿瘤的生物学特性和患者预后之间的关系，为临床预测化疗疗效、指导合理用药提供理论依据。   1  材料与方法   1.1

5、  材料   LCSC-1和LCSC-2亚群细胞：取材于同1例原发性肝细胞癌手术标本组织，通过原代细胞培养，采用有限稀释法克隆分离出经鉴定具有不同形态和生物学特征的两种细胞亚群，并且两种亚群细胞的致瘤性也不相同 4。主要试剂：DMEM、胎牛血清（FBS）、谷氨酰胺、青霉素、链霉素为美国Gibco公司产品；胰蛋白酶为Sigma公司产品；MTT、小鼠抗MDR1抗体、小鼠抗MRP抗体、小鼠抗LRP抗体、小鼠抗GST抗体、FITC标记兔抗小鼠IgG抗体为北京中山公司产品。   1.2  方法   人肝细胞癌LCSC-1、L

6、CSC-2亚群细胞置于温度为37 含5% CO2气体的培养箱中，选用含10%胎牛血清的DMEM培养基，常规培养两种亚群细胞。   （1）细胞培养 ：分别取对数生长期的LCSC-1、LCSC-2亚群细胞，用0.25%胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，调整浓度为1×107/ml。(2) 实验取100 l的细胞悬液分别加入5 ml的EP管中，每亚群细胞各种耐药蛋白检测设3个复管，每亚群细胞设立1同型对照；每管加入100 l Reagent A(固定液)，轻轻振荡使细胞处于单细胞状态，室温孵育30 min。(3) 加入3 ml的PBS（含0.1%NaN3和5%FBS）轻轻振荡混

7、匀。(4) 离心（800转/min,5min），沉淀细胞，弃上清液，剩约50 l液体。(5) 在检测MDR1的EP管中加入10 l抗MDR1抗体原液。(6)在检测MRP、LRP、GST的EP管中加入100 l的Reagent B（破膜剂）和分别抗MRP、抗LRP、抗GST抗体原液10 l，轻轻振荡、混匀。并用统一亚型抗体作阴性对照；37孵育60 min。(7) 用PBS液洗去未结合的一抗，加入荧光标记的抗小鼠或兔的二抗，37孵育30 min；PBS液洗去多余的二抗。(8) 加入3 ml的PBS轻轻振荡混匀。离心3 min（800转/分），去上清液。(9) 加鞘液(PBS)500 l，细胞重悬后

8、上机检测。或加入0.30.4 ml的1%多聚甲醛-0.01MPBS（ph7.4），振荡混匀后24 h内上机检测。(10) 流式细胞仪检测（激发光395 nm，发射光570 nm）：同型对照管调零后，每管测5000个细胞。   1.3  统计学处理方法   所有结果均以x±S表示，采用SPSS10.0软件进行t检验和析因方差分析进行组间比较，P0.05为有统计学意义。            2  结果   2

9、.1  LCSC-1、LCSC-2亚群细胞的药物敏感性   根据测得的每种药物不同的细胞抑制率，利用IC50计算软件分析药物作用LCSC-1、LCSC-2细胞后半数抑制浓度IC50。两种细胞亚群对阿霉素（ADM）、顺铂（DDP）、足叶乙甙(VP-16)等药物都具有一定的耐药性, 统计学分析显示，3种药物对LCSC-2亚群细胞和LCSC-1亚群细胞产生抑制的抑制率差异明显不同 (P0 .01) （见表1）。但LCSC-2亚群细胞对应这些化疗药的IC50值明显高于LCSC-1亚群细胞。提示LCSC-2亚群细胞较LCSC-1亚群细胞有较高耐药性。表1LCSC-1 细胞和

10、LCSC-2 细胞对化疗药物的敏感性表1显示，不同药物影响下细胞IC50差异有显着意义，F1254.389，P0.001。不同药物影响作用两两比较，LSD法，ADM与VP16、DDP与VP16两组药物差异均显着，P0.001。ADM与DDP两组药物差异不显着，P0.07。不同细胞药物作用下IC50差异也有显着意义，F249.651，P0.001。药物与细胞两个因素间存在交互效应，F163.181，P0.001。   2.2  MRP、LRP、GST、MDR1在LCSC-1和LCSC-2亚群细胞上的表达差异   经流式细胞仪检测，4种耐药蛋白MD

11、R1、MRP、LRP、GST在LCSC-1和LCSC-2两种亚群细胞上的表达有显着性差别（P0 .05）。其中在LCSC-2亚群细胞上MDR1、MRP的表达较LCSC-1亚群细胞明显增高（P0 .01）。详细结果见表2。   3  讨论   肝细胞癌对化疗药物产生耐药性是一种常见的临床现象，也是影响肝细胞癌综合疗效的原因之一。近年来，肿瘤多重耐药逐渐受到重视，肿瘤细胞对细胞毒药物的抵抗被认为是肿瘤化疗药物耐药的主要机制。研究证实：人类多药耐药基因及其基因产物在肿瘤的多药耐药性中起着重要作用，是肿瘤化疗疗效差的主要原因之一58。体外实验表明，抑制

12、多药耐药基因的表达可以增加耐药细胞对化疗药物的敏感性9,10 。有些肿瘤一开始即对化疗药物产生耐药，即内源性耐药；有些则是应用化疗药后产生耐药，即获得性耐药，两者有着相同的生物学基础。对那些无多药耐药基因表达的组织或器官发生的肿瘤，许多文献认为在化疗后和复发时，肿瘤才出现耐药基因的表达11,12。表2LCSC-1和LCSC-2细胞耐药相关蛋白MRP、LRP、GST、MDR1的荧光染色率情况   各种干细胞包括造血干细胞，特有表达耐药蛋白如MDR1和ABC转运蛋白13,14，可以将细胞毒性药物排出至细胞以外，起到自我保护作用，免除毒性物质对细胞的损害，因而对化疗药物诱导凋亡不

13、敏感15,16。如果肿瘤干细胞同样可能比其他肿瘤细胞高水平表达这些蛋白，那么肿瘤干细胞也许更具耐药性，这就可以解释化学治疗转移肿瘤失败的原因。目前，化疗只是杀灭了已分化的具有有限增殖潜能的肿瘤细胞，使得肿瘤缩小，但是如果肿瘤干细胞存活，它们将持续肿瘤生长的过程。杀灭肿瘤干细胞也许能更有效地治疗转移癌。   我们研究发现，肝细胞癌细胞自身存在耐药蛋白的表达，但不同的亚群耐药蛋白的表达水平不同，对化疗药物耐药程度也不相同，但都具有多药耐药性。LCSC-1细胞体外增殖快，倍增时间短，对化疗药物相对敏感；LCSC-2细胞亚群相对LCSC-1细胞亚群体外增殖慢，倍增时间长，对化疗药物

14、相对不敏感。两亚群细胞对化疗药物敏感性程度存在明显的差别(P0.05)。LCSC-1细胞耐药蛋白MRP、LRP、GST、MDR1的表达量较LCSC-2细胞低(P0.05)，有统计学意义。肿瘤细胞耐药蛋白的表达水平与其对化疗药物的敏感性呈负相关性。我们同时发现，肝细胞癌组织中的细胞具有异质性，而具有克隆扩增能力的亚群细胞相对具有耐药性，这类细胞具有肝干细胞的相似表面标志。我们在前面实验中证实LCSC-2 亚群具有干细胞的特性，本实验中又观察到其高表达耐药蛋白，证明耐药是干细胞的特征之一。肝细胞癌异质性亚群细胞耐药蛋白的异质性表达，可能介导了肿瘤细胞耐药异质性这一肿瘤的重要特性。 

15、60; LCSC-1和LCSC-2亚群细胞来源于同一个人。这种同一种病理类型同一个人来源的肝癌细胞未经化疗药物刺激诱导就存在耐药有关蛋白表达的差异，让我们联想到：这种差异在干细胞分化时就产生了，干细胞在不对称分裂时，不对称分裂产生细胞质、细胞器不均分布，分裂后形成两个不对称细胞，因此产生了生物学特性不同，耐药蛋白表达不同的异质性亚群细胞。这种理论也许解释了肿瘤患者在进行了化疗后肿瘤缩小或消失后但很快又复发的原因。因此，针对耐药肿瘤干细胞的靶向化疗可能是今后肿瘤治疗的方向。【参考文献】  1Roninson IB. The role of mdr1 (P-glycoprotein) g

16、ene in multidrug resistance in vitro and in vivo J. Biochem Pharmacol, 1992, 43 :95-1022 Batrakova EV, Li S, Elmquist W F, et al. Mechanism of sensitization of MDR cancer cells by Pluronic block copolymers: Selective energy depletion J.Br J Cancer， 2001, 85:1987-19973 Uchiyama-Kokubu N, Watanabe T.

17、Establishment and characterization of adriamycin-resistant human colorectal adenocarcinoma HCT-15 cell lines with multidrug resistance J. Anticancer-Drugs, 2001, 12: 769-7794 颜政，方池华.人肝细胞癌细胞亚群的克隆分离及异质性机制的初步研究J.世界华人消化杂志, 2006, 14:481-4855 Ng IO，Chi L. Liu，Sheung T. Fan, et al. Expression of p-glycopro

18、tein in Hepatocellular Carcinoma. A Determinant of Chemotherapy Response J. Am J Pathol, 2000, 113:355-3636 Biedier JL. Genetic aspects of multidrug resistance J. Cancer, 1992, 70:1799-1809 7 刘松，黄建富，殷凤峙，等. 原发性肝细胞癌中mdrl基因表达的研究J.中华实验外科杂志, 2000,17: 409-4108 Itsubo M, Ishikawa T, Toda G, et al. Irnmunohistochemical study of expression and cell