核壳纳米晶二硒化镉_硫化镉的合成及荧光法测定溶菌酶

1、核壳纳米晶二硒化镉/硫化镉的合成及荧光法测定溶菌酶俞英31,2周震涛11(华南理工大学材料科学与工程学院,广州5106402(华南师范大学化学系,广州510631摘要以32巯基丙酸为修饰剂,水相合成了具有发光效率高,光稳定性强等优良特性的CdSe 2/CdS 核壳纳米晶,粒径约为4n m,并将其成功用于溶菌酶的测定。在pH 7.4的Na 2HP O 42NaH 2P O 4缓冲溶液中,以365n m 激发,体系在642n m 处的荧光强度与溶菌酶的浓度呈线性关系,线性响应范围为0.58.0mg/L 和8.032mg/L;线性方程分别为F =0.97+2.21C (mg/L 和F =12.20+

2、0.70C (mg/L ;检出限为0.20mg/L 。将该方法应用于样品的测定,结果令人满意。关键词CdSe 2/CdS 核壳纳米晶,32巯基丙酸,溶菌酶,荧光光谱2004206214收稿;2004210226接受本文系广东省教育厅“千百十工程”优秀人才培养基金(No .QX02030和广东省自然科学基金(No .04010369资助项目1引言1998年,A livisat os 1和N ie 2等分别将结合了生物分子的CdSe /ZnS 核壳纳米晶作为荧光探针应用于生物体系,开创了纳米晶应用的新领域。纳米晶作为荧光探针的光学特性比传统的荧光染料探针如罗丹明6G 等有明显的优越性1。然而早期的

3、纳米晶都是在有机相中制备的,制备条件比较苛刻,成本较高,而在水相中合成纳米晶具有操作简单、成本低等优点3。W ang 等4,5曾将巯基乙酸包覆的CdS纳米晶用于蛋白质、核酸分子的测定。本研究发现单核纳米晶在水溶液中的荧光强度不稳定,而在水相中合成了被32巯基丙酸包覆的CdSe 2/CdS 核壳纳米晶,40d 内荧光强度保持不变,并将其成功的应用于溶菌酶的测定。2实验部分2.1仪器和试剂FE I 2TECANA I 12型透射电子显微镜(荷兰菲利浦公司(TE M 工作电压为120k V ;960CRT 荧光分光光度计(上海精密科学有限公司分析仪器总厂;pHS -3C 型酸度计(上海雷磁仪器厂。C

4、dCl 2中保存;5.0×10-3mol/L Na 2HP O 42NaH 2P O 4系列缓冲溶液;实验用水均为二次去离子水。2.2CdSe 2/CdS 核壳纳米晶的制备Na 2Se 2溶液参考文献6方法合成。在60mL 水中加入0.0110g CdCl 22.5H 2O 和32巯基丙酸10.4L,再用1mol/L 的Na OH 溶液调pH 为11.2得溶液。在200mL 水中加入0.0256g CdCl 2215H 2O 和32巯基丙酸24.4L,同样用1mol/L 的Na OH 溶液调pH 为11.2得溶液。用N 2将溶液在密闭体系中除氧30m in 。接着在适当的搅拌速度下,

5、向其中加入新制备的40mL 8.0×10-4mol/L 的无氧的Na 2Se 2溶液。将此反应液加热到96,回流3h,即可得到CdSe 2核纳米晶溶液。向上述溶液中加入用N 2除氧后的溶液,搅拌3m in,接着慢慢注入64mL 2.0×10-3mol/LNa 2S 9H 2O 溶液,并在N 2保护下搅拌2.5h,将此反应液加热到96,回流3h,即可得到CdSe 2/CdS 核壳纳米晶溶液。2.3实验方法在一系列5mL 比色管中分别加入1mL 2.4×10-4mol/L CdSe 2/CdS 纳米晶溶液(浓度以CdSe 2中第33卷2005年5月分析化学(FE NX

6、 I HUAXUE 研究简报Chinese Journal of Analytical Che m istry 第5期650652的Cd 2+浓度表示,1mL pH 为7.4的磷酸盐缓冲溶液和一定量的溶菌酶溶液,以水定容,摇匀,在30的恒温水浴中静置30m in 后,选择ex =365n m ,在em =440700n m 光谱扫描或在em =642nm 处测定空白与结合反应体系的荧光强度,并求出相对荧光强度(F 。3结果与讨论3.1CdSe 2/CdS 纳米晶的表征CdSe 2/CdS 纳米晶的最大吸收峰相对于CdSe 2纳米晶的最大吸收峰明显红移,表明CdSe 2/CdS 纳图1CdSe

7、2/CdS 纳米晶的电镜图Fig .1Trans m issi on electr on m icr oscop ic (TE M i m age of CdSe 2/CdS QD s 米晶比CdSe 2纳米晶的粒径大,CdS 已被成功修饰到CdSe 2纳米晶的外表面。通过透射电子显微镜观察该纳米晶的形状、大小及分布等情况,图1为CdSe 2/CdS 核壳纳米晶的电镜照片。由图可知,粒径约为4n m 。尺寸分布较为均一。CdSe 2/CdS 纳米晶的荧光峰位于500和640nm (见图2。随着溶菌酶的加入,体系的荧光峰强度逐渐增强,并且最大荧光峰波长逐渐蓝移(从641nm 移到634n m 。

8、3.2实验条件优化实验了Na 2B 4O 72Na OH,Na 2HP O 42NaH 2P O 4和B ritt on 2Robins on3种pH 不同缓冲溶液对体系F 的影响,本实验选择pH 为7.40的Na 2HP O 42NaH 2P O 4缓冲溶液1mL 调节体系的酸度。固定溶菌酶的浓度,体系的F 随着纳米晶浓度的增大而增强,实验选用1mL 2.4×10-4mol/L CdSe 2/CdS 纳米晶溶液作为实验用量。试剂加入顺序对F 的影响很小。体系的F 随温度的升高而减小,但升温会使纳米晶与溶菌酶之间的反应时间大大缩短。在30时,F 在10m in 后达到最大值,并在1h

9、 内保持稳定,故实验采用在30的恒温水浴中反应30m in 后进行测定。3.3干扰成分的影响考察了多种金属阳离子、阴离子、氨基酸和DNA 等共存物质对测定的影响。测定的干扰主要来自于Pb 2+、Hg 2+、Cu 2+、Fe 3+,但它们的允许浓度仍然高于生物体内这些离子的浓度,可以通过稀释消除它们的干扰;其它常见的离子如Mg 2+、Ca 2+以及氨基酸、DNA 的干扰小,允许量大。3.4机理讨论溶菌酶的加入使纳米晶的荧光强度有较大的增强,而BS A 的加入使纳米晶的荧光强度增加较小。因此,可认为这是由于溶菌酶的等电点为11.27,当体系的pH =7.40时,溶菌酶整体呈正电性,所以能通过静电相

10、互作用与表面带负电荷的纳米晶结合,使得纳米晶的F 显著增大;而BS A 的等电点为4197,在pH 7.40的情况下整体呈负电性,与带相同电荷的纳米晶相互排斥,但BS A 的氨基酸序列中带正电荷的氨基酸残基与该纳米晶有微弱的静电作用,因而使得F 轻微增大。3.5标准曲线在实验确定的最佳条件下,体系的F 与溶菌酶的浓度在0.58.0mg/L 和8.032.0mg/L 的线性回归方程分别为F =0.97+2.21C (mg /L ,r =0.9866;F =12.20+0.70C (mg/L ,r =0.9998,检出限由公式3/K 求出,为0.20mg/L 。3.6样品测定以新鲜蛋清为原料按文献

11、8方法提取溶菌酶。用本实验所建立的方法进行测定,效果较好,说明该方法可以用于溶菌酶实际样品的测定,结果如表1所示。尽管量子点发光探针的应用目前还不够广156第5期俞英等:核壳纳米晶二硒化镉/硫化镉的合成及荧光法测定溶菌酶泛,但其潜在的应用前景是不可估量的。表1实际样品中溶菌酶含量的测定(n=5Table1Deter m inati on results of lys ozy me(Lysin real sa mp les(n=5样品Sa mp les 本法测定值This method(mg/L加溶菌酶Lys added(mg/L测得值Found(mg/L回收率Recovery(%相对标准偏差R

12、S D(%,n=5References1B ruchezM J r,Mor onne M,Gin P,W eiss S,A livisat os A P.Science,1998,281:201320162Chan W C W,N ie S.Science,1998,281:201620184W ang L Y,Kan X W,Zhang M C,Zhu C Q,W ang L.A nalyst,2002,127:153115345W ang L Y,W ang L,Gao F,Yu Z Y,W u Z M.A nalyst,2002,127:9779807Chen Zengxie(陈曾燮,L

13、 iu J ing(刘兢,Luo Dan(罗丹.B ioche m istry Experi m ents(生物化学实验.Hefei(合肥:Chinese University Press of Science and Technol ogy(中国科技大学出版社,1994:2908Q i Xiaoqin(齐小芩.A pplied Science and Technology(应用科技,1999,(7:6Fluorescence D eterm i n a ti on of L ysozy m e w ith Cad m i u m D i2selen i de/Cadm i um Sulf i

14、 de Quan tu m D ots Syn thesi zed i n the Aqueous Soluti onYu Ying31,2,Zhou Zhentao11(College of M aterial Science and Engineering,South China U niversity of Technology,Guangzhou5106402(D epart m ent of Che m istry,South China N or m al U niversity,Guangzhou510631AbstractCad m iu m di2selenide/cad m

15、 ium sulfide core/shell quantu m dots(QD swere synthesized and modified by32mercap t op r op i onic acid(MP Ain aqueous s oluti on.I n contrast with conventi onal organic dyes, these QD s are more brighter,more stable against phot obleaching,and do not suffer blinking.The fluorescence intensity of t

16、hese QD s is als o more stable than MP A2capped CdS nanocrystals.The app licability of the results of these QD s t o the deter m inati on of lys ozy me was studied successfully.The pH value was selected at pH 7140,with excitati on and e m issi on wavelength at365n m and642n m,res pectively.Under op

17、ti m al conditi ons, linear relati onshi p was f ound bet w een the relative fluorescence intensity and the concentrati on in the range of 0158.0mg/L and8.032.2mg/L for lys ozy me(Lysand the linear equati on wasF=0.97+2121C (mg/LandF=12.20+0.70C(mg/L,res pectively.The detecti on li m it defined as three ti m es of the standard deviati on of the blank(3/K,of