急性早幼粒白血病复合型染色体易位及其临床预后相关性的研究

1、    急性早幼粒白血病复合型染色体易位 及其临床预后相关性的研究        【摘要】目的研究急性早幼粒白血病(acute promyelocytic leukemia, APL, M3)中复合型染色体易位与临床治疗、预后的关系。方法应用常规核型分析、荧光原位杂交和逆转录酶聚合酶链反应，检测了3例APL，M3。结果发现3例均有早幼粒白血病基因-维甲酸受体基因(promyelocytic leukemia gene-retinoic acid receptor g

2、ene, PML-RAR)融合基因转录本；核型呈复合型易位，除有15和17号染色体易位外还累及了5、11、16、22号多条染色体，并与临床预后有一定相关性。结论对APL复合型易位的检测和深入研究，对临床治疗监测和预后判断有一定指导意义。【关键词】急性早幼粒细胞白血病PML-RAR融合基因t(15;17)复合型易位荧光原位杂交逆转录酶聚合酶链反应STUDIES ON COMPLEX CHROMOSOMAL TRANSLOCATIONS AND THEIR RELEVANCE TO CLINICAL PROGNOSIS IN ACUTE PROMYELOCYTIC LEUKEMIASu Xinyi

3、ng, He Kaili, Niu Chao, Gu Baiwei, Cao Qi, Chen Zhu, Chen Saijuan*【Abstract】ObjectiveTo study the relationship between the complex chromosome translocation in acute promyelocytic leukemia(APL,M3) and clinical therapy and prognosis.MethodsChromosome translocations and PML-RAR fusion transcript in thr

4、ee APL patients were studied by using karyotypic analysis, fluorescence in situ hybridization and reverse transcriptase/polymerase chain reaction.ResultsThe findings revealed that all these cases had PML/RAR gene rearrangement. Apart from the chromosomes 15 and 17 involved in the translocation, othe

5、r multiple chromosomes including 5, 11, 16, 22 were also implicated in complex translocations, which to some extent seemed to be related with clinical prognosis.ConclusionThis study provides additional information for monitoring clinical therapy and prognostic evaluation.【Key words】Acute promyelocyt

6、ic leukemiaPML-RAR fusion genet(15;17)complex chromosome translocationsFluorescence in situ hybridizationReverse transcriptase/polymerase chain reaction急性早幼粒细胞性白血病(acute promyelocytic leukemia, APL)是急性粒细胞白血病(acute myeloid leukemia, AML)中一独特细胞形态学类型(即FAB分型中M3亚型)，它具有特征性的染色体易位t(15;17)(q22;q11-21)，易位的结果使

7、15q22的早幼粒白血病基因(PML)和17q11-21的维甲酸受体基因(RAR)形成PML-RAR融合基因，该融合基因是APL发病的分子基础。在APL中约90%以上的患者具有经典的t(15;17)染色体易位，尚有少数患者伴有变异型染色体易位，如本室发现的t(11,17)易位，以及其它实验室发现的t(5;17)染色体易位等。除此之外，少数APL患者除有第15和17号染色体受累外，还有第3条或更多条染色体受累。这部分患者染色体的异常与临床预后有一定相关。我们应用常规核型分析、双标记FISH、染色体涂染技术和RT/PCR方法分析了3例复合型易位，并探讨其临床意义。1材料和方法1.1标本来源患者均收

8、治于瑞金医院，诊断根据FAB分型标准1，均为APL(M3亚型)。标本取自初发或复发治疗前的骨髓。1.2临床资料例1：男，31岁，1995年10月入院。骨髓象：早幼粒细胞64.5%，诊断为APL(M3)。联合应用维甲酸和其它化疗药物1月后缓解。1.5年后复发，骨髓象原粒细胞和早幼粒细胞35%，经砷剂治疗1月后再次缓解。例2：男，24岁，1997年1月入院。骨髓象：早幼粒细胞达95.5%，外周血：早幼粒细胞79%，确诊为APL。联合应用维甲酸和其它药物化疗1月后缓解。例3：男，49岁，日本籍。1997年11月入院时已是APL第2次复发，联合使用维甲酸和其它化疗1月后缓解。7个月后第3次复发，经砷剂

9、治疗1月后获得第4次缓解。1.3方法细胞遗传学患者的骨髓细胞无需PHA刺激培养24小时，按常规方法制备染色体后进行R显带，并根据ISCN(1991)2进行核型分析。分子细胞遗传学用5、11、15、16、17、22号染色体全长探针(whole chromosome painting, WCP；地高辛标记的探针由Oncor公司生产，生物素标记的探针由Cambio公司生产)和t(15;17)易位的特异探针(Oncor公司和自行制备的YAC探针：YAC185B2、YAC417D9)与患者的染色体杂交，经荧光素抗体孵育后，在Nikon荧光显微镜下观察结果。检测过程按厂家推荐的条件进行。玻片染色体在70的

10、70%甲酰胺/2×SSC(pH7.0)溶液中变性2分钟，再经系列酒精脱水。WCP探针杂交前在75变性5分钟，而位点特异探针无需变性。37湿盒中杂交过夜。杂交后洗涤条件如下：WCP探针在43的50%甲酰胺/2×SSC(pH7.0)中各洗涤15分钟；Oncor公司的位点特异探针在45甲酰胺/2×SSC(pH7.0)和37甲酰胺/2×SSC(pH7.0)中各洗涤15分钟。YAC探针的洗涤条件按文献3报道。分子生物学应用一步法异硫氰酸胍-酚-氯仿方法抽提细胞总RNA。RT/PCR按本所以往报道4的方法进行。2结果2.1细胞遗传学例1为46，XY，t(15;17)

11、(q22;q11-q21),add(22)(p10)(1A)。例2为46，XY，t(15;17)(q22;q11-q21),dup(11)(q?)(1B)。例3为46，XY，t(5;15)(?;?),t(15;17)(q22;q11-q21),add(16)(p?)(1C)。2.2分子细胞遗传学FISH和染色体涂染结果如下。例1：用22号染色体探针进行涂染，发现一条为正常的22号染色体，另一条短臂加长的22号染色体短臂为一未知的染色体(2)。因标本有限，双标记FISH未做。例2：用11号染色体探针进行涂染，发现一条为正常的11号染色体，另一条长臂加长的11号染色体也被绿色荧光覆盖，说明加长的长

12、臂部分是由11号染色体自身复制获得的(3A)。双标记FISH(用PML和RAR特异性YAC探针)结果发现，1对红色信号位于15号染色体长臂的2区2带，1对绿色信号位于17号染色体长臂的1区2带，而红色和绿色的融合信号位于衍生15号染色体的长臂2区2带(3B)。例3：4A用5号(红色荧光信号)和15号(绿色荧光信号)染色体探针进行双色涂染，发现1条为正常的5号染色体(用chr5表示)，另1条5号染色体与1条15号染色体有交互易位(分别用der5及der15表示)。而另一条15号染色体因存在t(15;17),绿色信号的部分易位至17号染色体(4C)。4B用16号(红色荧光信号)和17号(绿色荧光信

13、号)染色体探针进行双色涂染，发现1条为正常的16号染色体(用chr16表示)，另一条短臂端与部分的17号染色体融合(用der16表示)，说明短臂的加长部分来源于17号染色体。而17号染色体由于存在t(15;17)，有部分信号易位至15号染色体(用der15,der17表示)(4C)。4C用15号(绿色荧光信号)和17号(红色荧光信号)染色体探针进行双色涂染，发现两条15号染色体均异常，即一条与5号染色体易位，用der5,der(15)t(5;15)表示(4A)，另一条与17号染色体易位，用der15,der(17)t(15;17)表示。17号染色体中的1条与15号染色体发生易位，用der(17

14、)t(15;17)表示，由4B可见在16号染色体有来自17号染色体的信号。4D显示双标记FISH结果，即红色信号为荧光素标记的15q22 PML基因的探针，绿色信号为地高辛标记的17q22 RAR基因的探针。由可见，红色的15号PML基因信号1对与绿色的17号RAR基因信号发生融合，另一对红色PML基因信号移位至der(5)，还有1对17号的绿色信号在17号染色体上。此结果结合以上的涂染结果，可知1条15号染色体PML基因与17号染色体RAR基因发生易位，而另一条PML基因5号染色体发生易位，即两条15号染色体PML基因分别参与了各自的易位。2.3RTPCR结果3例均检测到PML-RAR融合转

15、录本，且均为L型(长型)，象参考文献4。3讨论我们检测的150例APL患者中，96%具有经典的t(15；17)染色体易位及PML-RAR融合基因，其余4%的患者均伴有变异型和复合型染色体易位，其中1例为t(11；17)变异型易位，11号染色体受累的为PLZF基因，而17号染色体仍为RAR基因，自我实验室首次报道5，6以来，目前已发现有近10例，这些患者对维甲酸诱导分化疗法或化学疗法反应均较差或无效，临床预 13例APL患者的部分核型A：例1的异常核型t(15;17),add(22)(p10)，B：例2的异常核型，t(15;17),dup(11)，C：例3的异常核型t(5;15),t(15;17

16、)，add(16)2例1 22号染色体全长涂染结果可见1条正常22号染色体，另一条为add(22)，即(der22)3例2分子细胞遗传学分析结果A：例2患者的11号染色体全长涂染结果可见1条正常11号染色体，另一条为11号染色体自身复制导致长臂加长dup(11q)。B：双标记FISH(探针为YAC185B2、YAC417D9)：见1对红色的正常15号染色体信号，1对绿色的正常17号染色体信号，另有红、绿t(15;17)融合信号der15,t(15;17)4例3分子细胞遗传学分析结果A：5号(红色信号)与15(绿色信号)染色体全长涂染结果，可见t(5;15)；B：16号(红色信号)与17号(绿色

17、信号)染色体全长涂染结果，可见add(16)，部分来自于17号染色体；C：15号(绿色信号)与17号(红色信号)染色体全长涂染结果，可见t(15;17)；D：双标记FISHOncor公司检测t(15;17)的探针，可见der(17)t(15;17)融合信号及der(5)t(5;15)红色信号Fig 1Partial karyotype from 3 APL patientsA:Case 1 shows t(15;17), add(22)(p10);B:Case 2 with t(15;17), dup (11)；C:Case 3 with t(5;15),t(15;17),add(16)Fig

18、 2Result of chromosome 22 painting in case 1, demonstrates add(22) and a normal chromosome 22Fig 3Molecular cytogenetic results of case 2A:Study of chromosome 11 painting shows dup (11q);B:t(15;17)translocation, revealed by dual-color FISHFig4Molecular cytogenetic results of case 3A:Result of chromo

19、some 5 (red) and chromosome 15(green) painting in case 3, shows t(5;15),B:Result of chromosome 16(red) and chromosome 17 (green) painting in case 3 shows add(16), part of which comes from chromosome 17,C: and D:Result of karyotype t(15;17) and t(5;15), revealed by chromosome 15 and chromosome 17 dua

20、l-color painting and FISH后凶险7。此后国际上又发现了t(5；17)变异型染色体易位8，除17号染色体上RAR基因仍受累外，5号染色体累及的基因是NPM(nucleophosmin,核仁磷酸蛋白)9，由于该易位目前发现的病例较少，临床预后仍有待进一步积累资料。APL具有特异性的t(15;17)(q22;q11-21)染色体易位，易位的结果是使15q22的早幼粒白血病基因(PML)和17q11-21的维甲酸受体基因(RAR)形成PML-RAR融合基因，检测RAR和PML基因的重排可为APL提供一特异和敏感的指标。本文报告的3例都属复合型易位，经常规核型分析和显带技术，结合

21、RTPCR、FISH和染色体涂染技术均检测到t(15;17)易位，并证实了存在有PML-RAR融合基因。这三例除有t(15;17)(q22;q11-q21)易位外，例1还涉及22号染色体异常，22号染色体的短臂增长。由于该例患者标本有限，故是基因组的哪部分与之发生重组尚不清楚。例2还有11号染色体受累，但与Chen等5报道的t(11;17)易位受累的部位不同，而染色体涂染技术证实11号长臂的增长是自身长臂的复制所致，并且它也未参与17或15号染色体的重排。从临床分析，该例患者对维甲酸的治疗敏感，这就有别于伴t(11;17)的APL患者。例3的复合型易位与Zaccaria等10报道的伴t(5;1

22、5;16;17)的患者受累的染色体相同，而不同的是，本文报告的是两条15号染色体PML基因同时受累，而其中一条与17号染色体RAR基因形成经典的相互易位，另一条与5号染色体发生相互易位，且17号染色体部分重排到16染色体。本文所报告的3例复合型染色体易位的患者对诱导分化剂维甲酸和化疗均有效。第3例患者第2次复发后用维甲酸和化疗后仍能缓解，第3次复发后用砷剂治疗获得了第4次缓解。我们以往的研究表明，APL应用维甲酸诱导分化疗法或三氧化二砷的诱导凋亡方法，都是通过PML-RAR融合蛋白的靶向疗法，均可使PML-RAR融合蛋白发生降解，但其降解的分子机理及药物作用的时相有所差异11，12。本文3例复

23、合型易位的APL患者存在有PML-RAR融合蛋白，故对维甲酸和三氧化二砷仍然有效，这与伴t(11;17)患者的APL不同。但由于存在有多条染色体的受累，故预后较一般伴有经典染色体易位的患者要差，第3例已发生3次复发，第1例发生1次复发，第2例随访时间太短，有待进一步积累资料。高度复杂的染色体易位产生的机理之一可能与患者接受化疗等发生的继发性改变有关。联合应用常规核型分析、RT/PCR和FISH技术，研究APL中复合型染色体易位及其与临床预后的关系，对进一步阐明APL发生机理，进行临床治疗的监测，以及判断预后等具有重要的指导意义。参考文献1Bennett JM, Catovsky D, Dani

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