分子杂交技术

1、.分子杂交技术分子杂交技术互补的核苷酸序列通过Walson-Crick 碱基配对形成稳定的杂合双链分子DNA 分子的过程称为杂交。杂交过程是高度特异性的 ,可以根据所使用的探针已知序列进行特异性的靶序列检测。杂交的双方是所使用探针和要检测的核酸。该检测对象可以是克隆化的基因组DNA, 也可以是细胞总DNA 或总 RNA 。根据使用的方法被检测的核酸可以是提纯的，也可以在细胞内杂交, 即细胞原位杂交。 探针必须经过标记，以便示踪和检测。使用最普遍的探针标记物是同位素, 但由于同位素的安全性，近年来发展了许多非同位素标记探针的方法。核酸分子杂交具有很高的灵敏度和高度的特异性, 因而该技术在分子生物

2、学领域中已广泛地使用于克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、 基因组中特定基因序列的定性、 定量检测和疾病的诊断等方面。 因而它不仅在分子生物学领域中具有广泛地应用 ,而且在临床诊断上的应用也日趋增多。第一节核酸探针标记的方法核酸探针根据核酸的性质，可分为 DNA 和 RNA 探针 ; 根据是否使用放射性标记物的与否,可分为放射性标记探针和非放射性标记探针;根据是否存在互补链,可分为单链和双链探针;根据放射性标记物掺入情况,可分为均匀标记和末端标记探针。下面将介绍各种类型的探针及标记方法。一、双链DNA 探针及其标记方法分子生物研究中，最常用的探针即为双链DNA 探针，它广泛应用于基因的鉴定、临床诊

3、断等方面。双链 DNA 探针的合成方法主要有下列两种:切口平移法和随机引物合成法。1. 切口平移法 (nick translation) 当双链 DNA 分子的一条链上产生切口时 ,E.coli DNA 聚合酶就可将核苷酸连接到切口的 3'羟基末端。同时该酶具有从 5' 3'的核酸外切酶活性 ,能从切口的 5'端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同时又在切口的3'端补上核苷酸 ,从而使切口沿着DNA 链移动 ,用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸，将放射性同位素掺入到合成新链中。最合适的切口平移片段一般为50-500 个核苷酸。切口平移反应受几种因素的影响

4、: (a) 产物的比活性取决于 -32 PdNTP的比活性和模板中核苷酸被置换的程度。(b) DNA 酶的用量和E.coli DNA聚合酶的质量会影响产物片段的大小。(c) DNA模板中的抑制物如琼脂糖会抑制酶的活性, 故应使用仔细纯化后的DNA 。材料：待标记的 DNA 。设备：高速台式离心机，恒温水浴锅等。试剂：(1)10 ×切口平移缓冲液:0.5mol/L Tris·Cl (pH7.2); 0.1mol/L MgSO4 ; 10mmol/L DTT; 100g/ml。BSA(2)未标记的 dNTP 原液 : 除同位素标记的脱氧三磷酸核苷酸外 ,其余 3 种分别溶解于

5、50mmol/L Tris ·Cl (pH7.5) 溶液中 ,浓度为 0.3mmol/L 。(3) -32 P dCTP 或 -32 PdATP:400 Ci/mmol, 10Ci/ 。l(4) E.coli DNA聚合酶 (4 单位 / l):溶于 50 g/ml BSA, 1mmol/L DTT, 50% 甘油， 50mmol/L Tris ·Cl(pH7.5) 中。(5)DNA 酶 :1mg/ml 。(6)EDTA :200mmol/L (pH8.0)。(7)10mol/L NH4Ac 。操作步骤 :(1) 按下列配比混合 :未标记的 dNTP 10l10×

6、切口平移缓冲液5l待标记的DNA 1g -32 PdCTP 或 dATP(70Ci) 7 lE.coli DNA 聚合酶4 单位DAN 酶 I 1 l加水至终体积50l(2) 置于 15水浴 60 分钟。(3) 加入 5l EDTA 终止反应。.'.(4) 反应液中加入醋酸铵,使终浓度为0.5mol/L,加入两倍体积预冷无水乙醇沉淀回收DNA 探针。 注意 1 、3H ，32P 及 35S 标记的 dNTP 都可使用于探针标记，但通常使用 -32 P-dNTP 。2、DNA 酶的活性不同，所得到的探针比活性也不同，DNA 酶活性高，则所得探针比活性高，但长度比较短。2. 随机引物合成法

7、随机引物合成双链探针是使寡核苷酸引物与DNA 模板结合 ,在 Klenow 酶的作用下 ,合成 DNA 探针。合成产物的大小、产量、比活性依赖于反应中模板、引物、dNTP 和酶的量。通常,产物平均长度为400-600 个核苷酸。利用随机引物进行反应的优点是：(1)Klenow 片段没有 5' 3'外切酶活性 ,反应稳定 ,可以获得大量的有效探针。(2)反应时对模板的要求不严格 ,用微量制备的质粒 DNA 模板也可进行反应。 (3)反应产物的比活性较高 ,可达 4×109 cpm/ g探针。 (4)随机引物反应还可以在低熔点琼脂糖中直接进行。材料：待标记的DNA 片段。

8、设备：高速台式离心机，恒温水浴锅等。试剂：(1)随机引物（随机六聚体或断裂的鲑鱼精子DNA ）。(2)10 ×随机标记缓冲液：900mmol/L HEPES (pH6.6); 10mmol/L MgCl2。(3)Klenow 片段。(4)20mmol/L DTT 。(5)未标记的dNTP 溶液： dGTP、 dCTP 和 dTTP 溶液，各 5mmol/L 。(6) -32 P dATP：比活性 >3000Ci/mmol, 10Ci/ l。(7)缓冲液 A ：50mmol/L Tris ·Cl （ pH7.5 ） ; 50mmol/L NaCl; 5mmol/

9、L EDTA（ pH8.0 ）; 0.5% SDS 。操作步骤 :(1) 200ng 双链 DNA(1l) 和 7.5ng 随机引物 (1 l)混合后置于eppendorf 管内 ,水浴煮沸 5 分钟后，立即置于冰浴中1 分钟。(2) 与此同时 ,尽快在一置于冰浴中的 0.5ml eppendorf 管内混合下列化合物 :20mmol/L DTT 1l未标记的dNTP 溶液1l10×随机标记缓冲液1l -32 P dA TP(比活性 >3000Ci/mmol; 10Ci/ l) 3 lddH2O 1l(3) 将步骤 (1)eppendorf 管中的溶液移到步骤 (2)

10、管中。(4) 加入 5 单位 (约 1l) Klenow 片段 , 充分混合 , 在微型离心机中以12000g 离心 1-2 秒 , 使所有溶液沉于试管底部,在室温下保温 3-16 小时。(5) 在反应液中加入 10l缓冲液 A 后,将放射性标记的探针保存在 -20下备用。同时计算放射比活性。注意 1、引物与模板的比例应仔细调整，当引物高于模板时，反应产物比较短，但产物的累积较多；反之，则可获得较长片段的探针。2、模板 DNA 应是线性的，如为超螺旋DNA ，则标记效率不足50%。二、单链DNA 探针用双链探针杂交检测另一个远缘DNA 时 ,探针序列与被检测序列间有很多错配。而两条探针互补链之

11、间的配对却十分稳定 ,即形成自身的无效杂交,结果使检测效率下降。采用单链探针则可解决这一问题。单链DNA 探针的合成方法主要有下列.'.两种1) 以 M13 载体衍生序列为模板,用 Klenow 片段合成单链探针; (2)以 RNA 为模板 , 用反转录酶合成单链cDNA 探针。1. 从 M13 载体衍生序列合成单链DNA 探针合成单链DNA 探针可将模板序列克隆到噬粒或M13 噬菌体载体中 ,以此为模板 ,以特定的通用引物或以人工合成的寡合苷酸为引物, 在a-32P-dNTP的存在下 ,由 Klenow 片段作用合成放射标记探针，反应完毕后得到部分双链分子。在克隆序列内或下游用限制性

12、内切酶切割这些长短不一的产物,然后通过变性凝胶电泳(如变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 )将探针与模板分离开。双链 RF 型 M13 DNA 也可用于单链 DNA 的制备 ,选用适当的引物即可制备正链或负链单链探针。材料：已制备好的单链DNA 模板（方法参见第十章中有关内容）。设备：高速台式离心机，恒温水浴锅等。试剂：(1)10 ×Klenow 缓冲液： 0.5mol/L NaCl, 0.1mol/L TrisCl(pH7·.5); 0.1mol/L MgCl2。(2)0.1mol/L DTT溶液。(3) -32 P dA TP：3000Ci/mmol, 10 Ci/ l。(4)40

13、mmol/L 和 20mmol/L 的未标记的dNTP 溶液。(5)dCTP,dTTP,dGTP 各 20mmol/L 的溶液。(6) Klenow 片段（ 5 单位 /ml）。(7)适宜的限制酶，如EcoR、 Hind 等。(8)0.5mol/L EDTA（pH8.0 ）。操作步骤：(1)在 0.5ml eppendorf 管中混合如下溶液：单链模板（约0.5pmol ） 1mg适当引物5pmol10×Klenow 缓冲液3ml加水至20ml(2)将 eppendorf 管加热到85 5 分钟，在 30 分钟内，使小离心管降到37；(3)依次加入：DTT 2mla-32PdA TP

14、 5ml未标记的dATP 1mldGTP,dCTP,dTTP 混合液1ml混合均匀后，稍离心使之沉于试管底部。(4)加 1ml （ 5 单位） Klenow 酶室温下30 分钟。.'.(5)加 1ml20mmol/L 未标记的 dATP 溶液 20 分钟。(6)68 加热 10 分钟，使 Klenow 片段失活。调整 NaCl 浓度，使之适宜于酶切。(7)加入 20 单位限制性内切酶（如 EcoR , Hind 等）酶切 1 小时。(8)酚 /氯仿抽提 DNA ，乙醇沉淀以去除 dNTP 或加 0.5mol/L EDTA(pH8.0)至终浓度 10mmol/L 。(9)用电泳方法分离放

15、射性标记的探针。2. 从 RNA 合成单链cDNA 探针cDNA 单链探针主要用来分离cDNA 文库中相应的基因。用RNA 为模板合成cDNA探针所用的引物有两种: (1)用寡聚 dT 为引物合成cDNA 探针。本方法只能用于带Poly(A) 的 mRNA, 并且产生的探针极大多数偏向于mRNA 3' 末端序列。 (2) 可用随机引物合成cDNA 探针。该法可避免上述缺点, 产生比活性较高的探针。但由于模板RNA 中通常含有多种不同的RNA分子 ,所得探针的序列往往比以克隆DNA为模板所得的探针复杂得多, 应预先尽量富集mRNA 中的目的序列。反转录得到的产物RNA/DNA 杂交双链经

16、碱变性后,RNA 单链可被迅速地降解成小片段,经 Sephadex G-50 柱层析即可得到单链探针。材料：已提纯的RNA 或 mRNA设备：高速台式离心机，恒温水浴锅等。试剂：(1)合适的引物：随机引物或oligo(dT)15-18 。(2)5mmol/L dGTP, dA TP dCTP, dTTP。(3) a-32PdCTP(>3000Ci/mmol, 10mCi/ml)。(4)反转录酶 (200000 单位 /ml) 。(5)100mmol/L DTT 。(6)250mmol/L MgCl2 。(7)1mol/L KCl 。(8)0.5mol/L EDTA (pH8.0)

17、 。(9)10% SDS 。(10)RNasin(40 单位 /ml) 。操作步骤 :(1)在已置于冰浴中的灭菌离心管中加入下列试剂：RNA 或 mRNA 10.0ml合适的产物 (1mg/ml) 10.0ml1mol/L Tris Cl(pH7·.6) 2.5ml1mol/L KCl 3.5ml250mmol/L MgCl2 2.0ml5mmol/L dNTP 10.0mla-32PdCTP 10.0ml0.1mol/L DTT 2.0mlRnasin 20U加水至48ml反转录酶 (200000 单位 /ml) 2ml混匀后 ,稍稍离心， 37保温 2 小时。(2) 反应完毕后加

18、入下列试剂：0.5mol/L EDTA (pH8.0) 2ml 10% SDS 2ml(3) 加入 3ml 3mol/L NaOH 。68保温 30 分钟以水解 RNA 。(4)冷却至室温后 , 加入 10ml 1mol/L Tris Cl·(pH7.4) 。混匀。然后加入 3ml 2mol/L HCl 。(5)酚 /氯仿抽提后，用 Sephadex G-50 柱层析或乙醇沉淀法分离标记的探针。 注意 RNA 极易降解，因而实验中的所有试剂和器皿均应在DEPC 处理后，灭菌备用。三、末端标记DNA 探针现以 Klenow 片段标记 3'末端为例说明末端标记的方法。.'

19、.1、材料：待标记的双链含凹缺3'末端的 DNA 。2、设备：高速台式离心机，水浴锅等。3、试剂：(1)3 种不含标记的dNTP 各为 200mmol/L 。(2)合适的限制酶。(3) -32P dNTP:3000Ci/mmol, 10mCi/ul 。(4)Klenow 片段 (5U/ml) 。(5)10 ×末端标记缓冲液:0.5mol/L Tris Cl·(pH7.2), 0.1mol/L MgSO4, 1mmol/L DTT, 500mg/ml BSA。4、操作步骤：(1)25 l反应体系中用合适的限制酶酶切1g的 DNA 。(2)按下列成分加入试剂并混匀：已酶

20、切的DNA 1mg (25ml)10×末端标记缓冲液5ml2mmol/L3 种dNTP 1mla-32P-dNTP适量加水至50ml(3)加入 1 单位的 Klenow 片段 ,室温下反应30 分钟。(4)加入 1ml 2mmol/L第四种核苷酸溶液, 室温保温15 分钟。(5)70 加热 5 分钟 ,终止反应。(6)用酚 /氯仿抽提后 ,用乙醇沉淀来分离标记的DNA, 或用 Sephdadex G-50 柱层析分离标记的DNA 。注意 1、利用本方法可对DNA 分子量标准进行标记，利用它可定位因片段太小而无法在凝胶中观察的DNA 片段。2、对 DNA 的纯度不很严格，少量制备的质粒

21、也可进行末端标记合成探针。3、末端标记还有其他的一些方法，如利用T4 多核苷酸激酶标记脱磷的5'端突出的DNA 和平末端凹缺DNA 分子，也可利用该酶进行交换反应标记5'末端。四、寡核苷酸探针利用寡核苷酸探针可检测到靶基因上单个核苷酸的点突变。常用的寡核苷酸探针主要有两种:单一已知序列的寡核苷酸探针和许多简并性寡核苷酸探针组成的寡核苷酸探针库。单一已知序列寡核苷酸探针能与它们的目的序列准确配对,可以准确地设计杂交条件, 以保证探针只与目的序列杂交而不与序列相近的非完全配对序列杂交, 对于一些未知序列的目的片段则无效。1、材料：待标记的寡核苷酸(10pmol/ l)。2、设备：高

22、速离式离心机，恒温水浴锅等。3、试剂：(1)10 ×T4 多核苷酸激酶缓冲液:0.5mol/LTris ·Cl (pH7.6), 0.1mol/LMgCl2, 50mmol/LDTT, 1mmol/LSpermidine ·HCl,1mmol/L EDTA (pH8.0) 。(2) -32 P ATP(比活性 7000Ci/mmol; 10mCi/ml) 。(3)T4 多核苷酸激酶（10 单位 /ml ）。4、操作步骤：(1)100ng 寡核苷酸溶于30ml 水中。置 65变性 5 分钟，迅速置冰溶中。(2)立即加入下列试剂：10×激酶缓冲液5mlg-3

23、2PA TP(比活性 7000Ci/mmol;10mCi/ml) 10mlT4 多核苷酸激酶2ml加水至50ml混匀后置37水浴 20 分钟。(3)再加入 20 单位 T4 多核苷酸激酶，置37水浴 20 分钟后立即置冰浴中。(4)Sephadex G-50 柱层析。此方法是在每个探针的5'末端多加了一个磷酸，理论上，这会影响其与DNA 的杂交。因此，建议使用Klenow DNA聚合酶的链延伸法获得高放射性的寡核苷酸探针。.'.除了常见的同位素标记探针外， 还有利用非同位素标记探针和杂交的方法， 许多公司都有不同的非同位素标记探针的杂交系统出售，可根据这些公司所提供的操作步骤进

24、行探针的标记和杂交。五、 RNA 探针许多载体如pBluescript, pGEM 等均带有来自噬菌体SP6 或 E.coli 噬菌体 T7 或 T3 的启动子 , 它们能特异性地被各自噬菌体编码的依赖于DNA 的 RNA 聚合酶所识别 ,合成特异性的RNA 。在反应体系中若加入经标记的NTP，则可合成RNA 探针。RNA探针一般都是单链,它具有单链DNA探针的优点,又具有许多DNA单链探针所没有的优点，主要是：RNANA杂交体比DNANA 杂交体有更高的稳定性,所以在杂交反应中RNA 探针比相同比活性的 DNA 探针所产生信号要强。RNA:RNA 杂交体用RNA 酶 A 酶切比 S1 酶切

25、DNA:RNA杂交体容易控制,所以用 RNA探针进行RNA 结构分析比用DNA 探针效果好。噬菌体依赖DNA 的 RNA 聚合酶所需的rNTP 浓度比 Klenow 片段所需的dNTP 浓度低 ,因而能在较低浓度放射性底物的存在下 ,合成高比活性的全长探针。用来合成RNA 的模板能转录许多次,所以 RNA 的产量比单链DNA 高。并且用来合成RNA 的模板能转录多次，可获得比单链DNA 更高产量的RNA 。反应完毕后，用无RNA 酶的 DNA 酶处理 ,即可除去模板DNA, 而单链 DNA 探针则需通过凝胶电泳纯化才能与模板DNA 分离。另外噬菌体依赖于DNA 的 RNA 聚合酶不识别克隆DN

26、A 序列中的细菌、 质粒或真核生物的启动子，对模板的要求也不高 ,故在异常位点起始RNA 合成的比率很低。因此, 当将线性质粒和相应的依赖DNA 的 RNA 聚合酶及四种rNTP 一起保温.'.时 ,所有 RNA 的合成 ,都由这些噬菌体启动子起始。而在单链DNA 探针合成中 ,若模板中混杂其他 DNA 片段 ,则会产生干扰。但它也存在着不可避免的缺点，因为合成的探针是RNA ，它对 RNase 特别敏感，应而所用的器皿试剂等均应仔细地去除RNase；另外如果载体没有很好地酶切则等量的超螺旋DNA 会合成极长的RNA ，它有可能带上质粒的序列而降低特异性。第二节几种常见的杂交分子杂交是

27、通过各种方法将核酸分子固定在固相支持物上，然后用放射性标记的探针与被固定的分子杂交，经显影后显示出目的DNA 或 RNA 分子所处的位置。根据被测定的对象，分子杂交基本可分为以下几大类：(1) Southern 杂交NA 片段经电泳分离后,从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上,然后与探针杂交。被检对象为DNA, 探针为 DNA 或 RNA 。(2) Northern 杂交 :RNA 片段经电泳后 ,从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上,然后用探针杂交。 被检对象为RNA, 探针为 DNA或 RNA。根据杂交所用的方法,另外还有斑点 (dot) 杂交、狭槽 (slot)杂交和菌落原位杂交等。有3 种

28、固相支持体可用于杂交:硝酸纤维素滤膜、尼龙膜和Whatman 541 滤纸。不同商标的尼龙膜需要进行不同的处理，在DNA 固定和杂交的过程中要严格按生产厂家的说明书来进行。Whatman 541 滤纸有很高的湿强度, 最早用于筛选细菌菌落。该滤纸主要用于筛选一些基因文库。固定化 DNA 的杂交条件基本与使用硝酸纤维素滤膜时所建立的条件相同。Whatman 541 滤纸与硝酸纤维素滤膜相比有一些优点 :它更便宜 ,杂交中更耐用 ,干燥过程中不易变形和碎裂等。 然而若变性过程不小心 ,杂交信号的强度会明显弱于用硝酸纤维素滤膜时所得到的信号强度。因此 ,常规的细菌筛选和各种杂交时仍选用硝酸纤维素滤膜

29、作为固相支持体。分子杂交技术（一）一、概述前面已经介绍了核酸分子单链之间有互补的碱基顺序，通过碱基对之间非共价键（主要是氢键） 的形成即出现稳定的双链区，这是核酸分子杂交的基础。杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序（即某种程度的同源性）就可以形成杂交双链。分子杂交可在DNA 与 DNA 、RNA 与 RNA或 RNA 与 DNA 的二条单链之间进行。由于DNA 一般都以双链形式存在，因此在进行分子杂交时，应先将双链DNA 分子解聚成为单链，这一过程称为变性，一般通过加热或提高pH 值来实现。使单链聚合双链的过程称为退火或复性。

30、用分子杂交进行定性或定量分析的最有效方法是将一种核酸单链用同位素或非同位素标记成为探针，再与另一种核酸单链进行分子杂交。.'.核酸杂交技术基本上是Hall 等 1961 年的工作开始的， 探针与靶序列在溶液中杂交，通过平衡密度梯度离心分离杂交体。该法很慢、费力且不精确， 但它开拓了核酸杂交技术的研究。Bolton 等 1962 年设计了第一种简单的固相杂交方法，称为 DNA-琼脂技术。 变性 DNA 固定在琼脂中， DNA 不能复性， 但能与其它互补核酸序列杂交。典型的反应是用放射性标记的短DAN或 RNA 分子与胶中DNA 杂交过夜，然后将胶置于柱中进行漂洗，去除游离探针，在高温、低

31、盐条件下将结合的探针洗脱，洗脱液的放射性与结合的探针量呈正比。该法尤其适用于过量探针的饱和杂交实验。60 年代末， Britten 等设计了另一种分析细胞基因组的方法。该法是研究液相中DNA 的复性以比较不同来源核酸的复杂度，典型的方法是： 从不同生物体 （细菌、酵母、鱼和哺乳动物等）内分离DNA ，用水压器剪切成长约450 核苷酸（ nt）的片段。剪切的DNA 液（含 0.12mol/L 磷酸盐缓冲液或0.18mol/l Na+ ），经煮沸使dsDNA 热变性成ssDNA 。然后冷至约60，在此温度孵育过程中，测定溶液一定时间内的UV260nm 的吸光度（减色效应）来监测互补链的复性程度。通

32、常该实验可比较不同来源生物DNA 的复性速率，并可建立序列复杂度与动力学复杂度间的关系。60 年代中期 Nygaard 等的研究为应用标记DNA 或 RNA 探针检测固定在硝酸纤维素（NC）膜上的 DNA 序列奠定了基础。如 Brown 等应用这一技术评估了爪蟾rRNA 基因的拷贝数。RNA 在代谢过程中被3H 尿嘧啶标记，并在过量的情况下与膜上固定的基因组DNA 杂交，继而用RNase 处理，消化非特异性结合的RNA 。漂洗后计数以测定杂交探针的量。通过计算与已知量DNA 杂交的 RNA 量即可评估rRNA 基因数。由于当时缺乏特异探针，这种方法不能用于研究其它特异基因的表达，这些早期过量探

33、针膜杂交试验实际上是现代膜杂交实验的基础。进入 70 年代早期，许多重要的发展促进了核酸杂交技术的进展。例如，对特异基因转录产物的分析和对动力学杂交实验又有兴趣。固相化的Poly U Sepharose和寡（ dT ）- 纤维素使人们能从总RNA 中分离 Poly A+ RNA 。用 mRNA 的经纯化技术可从网织红细胞总RNA 中制备 -和 -珠蛋白 mRNA 混合物。这些珠蛋白mRNA 首次被用于合成特异的探针以分析珠蛋白基因的表达。由于制备cDNA 探针很繁琐，所获得cDNA 的长度和纯度也不稳定。所以寻求新的探针来源是使分子杂交技术进一步推广的基础。70 年代末期到80 年代早期，分子

34、生物学技术有了突破性进展，限制性内切酶的发展和应用使分子克隆成为可能。各种载体系统的诞生， 尤其是质粒和噬菌体DAN 载体的构建，使特异性DNA 探针的来源变得十分丰富。人们可以从基因组DNA文库和 cDNA 文库中获得特定基因克隆，只需培养细菌，便可提取大量的探针DNA 。迄今为止，已克隆和定性了许多特异DNA 探针。由于固相化学技术和核酸自动合成仪的诞生，现在可常规制备18100 个碱基的寡核苷酸探针。应用限制酶和Southern印迹技术，用数微克DNA 就可分析特异基因。特异DNA 或 RNA 序列的量和大小均可用Southern 印迹和 Northern 印迹来测定，与以前的技术相比，

35、大大提高了杂交水平和可信度。.'.尽管取得了上述重大进展，但分子杂交技术在临床实用中仍存在不少问题，必须提高检测单拷贝基因的敏感性，用非放射性物质代替放射性同位素标记探针以及简化实验操作和缩短杂交时间，这样，就需要在以下三方面着手研究：第一，完善非放射性标记探针；第二，靶序列和探针的扩增以及信号的放大；第三，发展简单的杂交方式，只有这样，才能使DNA 探针实验做到简便、快速、低廉和安全。二、探针 -靶反应从化学和生物学意义上理解，探针是一种分子，它带有供反应后检测的合适标记物，并仅与特异靶分子反应。抗原-抗体、外源凝集素 - 碳水化合物、亲和素-生物素、受体 -配基（ ligand ）

36、以及互补核酸间的杂交均属于探针- 靶分子反应。蛋白质探针（如抗体）与特异靶分子是通过混合力（疏水、离子和氢键）的作用在少数特异位点上的结合，而核酸探针与互补链的反应则是根据杂交体的长短不同，通过氢键在几十、几百甚至上千个位点上的结合。因为有机溶液可降低杂交体的稳定性，所以，疏水反应对互补核酸链的结合也有一定的作用，但对其特异性影响甚微。核苷酸经某一原子、功能基团或长侧链修饰后仍可能进行碱基配对，这取决于修饰的部位和修饰的性质。这一特性有助于理解非放射性核酸探针标记物的设计和125I 与 DNA 探针的化学结合。能与核酸结合的单一原子有银、溴和碘等， 这些元素可与嘧啶 （胸腺嘧啶除外）环的C-5

37、 位或嘌呤环的C-8 位反应而不影响氢键的形成。溴亦可与胸腺嘧啶的C-6 位结合。而胞嘧啶的C-4 和腺嘌呤的N-6 就不能被修饰，否则会影响碱基配对，尽管C 的 N-4 位和 A 的 N-6 位参与了氢键形成，但它们也是标记位点。 这是因为标记的探针每1kb 只掺入 10 30 个修饰碱基，即仅 4%12%的单个碱基被修饰的类似物取代了。尽管掺入位点处的碱基配对较弱或不存在，但对整个杂交分子的稳定性影响很小。防止氢键破坏的一种方法就是修饰探针，即探针克隆入M13 载体中，只修饰载体区而不修饰插入片段。当用放射性同位素32P 和 35S 标记核酸时，由于同位素是掺入核酸骨架的磷酸二脂键中，因此

38、碱基未发生任何修饰。在5端的磷酸基团上可进行化学修饰，这是标记寡核苷酸探针的有效方法。因为这种方法是在一个探针分子上标记一个检测的基团，所以，对长的克隆探针不适用。此外，还可利用修饰的碱基来增加杂交的稳定性和特异性。2-氢基腺嘌呤可替代寡核苷酸探针中的腺嘌呤通过形成3 个氢键以增加杂交体的稳定性。另外，在G-C 丰富的 RNA 探针中，可用次黄嘌呤代替鸟嘌呤以获得特异的杂交。因为次黄嘌呤和鸟嘌呤间只形成 2 个氢键，有效地降低了杂交体的Tm 值，这样， Tm 值与杂交温度更接近，杂交的严格性就增加了，因此，也就增加了特异性。很显然， 结合位点的不同和可检测基团与检测系统的不同，可派生出很多核酸

39、探针标记方法。这是由核酸的化学结构和性质所决定的。只有在对核酸分子的探针-靶反应的化学本质有了深入了解之后，才能更好地理解后面的章节内容。三、核酸探针的种类.'.基因探针根据标记方法不同可粗分为放射性探针和非放射性探针两大类，根据探针的核酸性质不同又可分为DNA 探针，RNA 探针， cDNA 探针， cRNA 探针及寡核苷酸探针等几类，DNA 探针还有单链和双链之分。下面分别介绍这几种探针。（一） DNA 探针DNA 探针是最常用的核酸探针，指长度在几百碱基对以上的双链DNA 或单链 DNA 探针。现已获得DNA 探针数量很多，有细菌、病毒、原虫、真菌、动物和人类细胞DNA 探针。这

40、类探针多为某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列。这些DNA 片段须是特异的，如细菌的毒力因子基因探针和人类Alu 探针。这些DNA 探针的获得有赖于分子克隆技术的发展和应用。以细菌为例，目前分子杂交技术用于细菌的分类和菌种鉴定比之G+C 百分比值要准确的多，是细菌分类学的一个发展方向。加之分子杂交技术的高敏感性，分子杂交在临床微生物诊断上具有广阔的前景。细菌的基因组大小约5×106bp，约含 3000 个基因。各种细菌之间绝大部分DNA 是相同的，要获得某细菌特异的核酸探针，通常要采取建立细菌基因组 DNA 文库的办法，即将细菌DNA 切成小片段后分别克隆得到包含基因组的全信息

41、的克隆库。然后用多种其它菌种的 DNA 作探针来筛选，产生杂交信号的克隆被剔除，最后剩下的不与任何其它细菌杂交的克隆则可能含有该细菌特异性DNA 片段。将此重组质粒标记后作探针进一步鉴定，亦可经DNA 序列分析鉴定其基因来源和功能。因此要得到一种特异性 DNA 探针，常常是比较繁琐的。探针 DNA 克隆的筛选也可采用血清学方法，所不同的是所建DNA 文库为可表达性， 克隆菌落或噬斑经裂解后释放出表达抗原，然后用来源细菌的多克隆抗血清筛选阳性克隆，所得到多个阳性克隆再经其它细菌的抗血清筛选，最后只与本细菌抗血清反应的表达克隆即含有此细菌的特异性基因片段，它所编码的蛋白是该菌种所特有的。用这种表达

42、文库筛选得到的显然只是特定基因探针。对于基因探针的克隆尚有更快捷的途径。这也是许多重要蛋白质的编码基因的克隆方法。该方法的第一步是分离纯化蛋白质，然后测定该蛋白的氨基或羟基末端的部分氨基酸序列，然后根据这一序列合成一套寡核苷酸探针。用此探针在DNA文库中筛选，阳性克隆即是目标蛋白的编码基因。值得一提的是真核细胞和原核细胞DNA 组织有所不同。真核基因中含有非编码的内含子序列，而原核则没有。因此，真核基因组DNA 探针用于检测基因表达时杂交效率要明显低于cDNA 探针。DNA 探针（包括cDNA 探针）的主要优点有下面三点：这类探针多克隆在质粒载体中，可以无限繁殖，取之不尽，制备方法简便。DNA

43、 探针不易降解（相对RNA 而言），一般能有效抑制DNA 酶活性。 DNA 探针的标记方法较成熟，有多种方法可供选择，如缺口平移，随机引物法，PCR 标记法等，能用于同位素和非同位素标记。（二） cDNA 探针cDNA （complementary DNA ）是指互补于mRNA 的 DNA 分子。 cDNA 是由 RNA 经一种称为逆转录酶（reversetranscriptase）的 DNA 聚合酶催化产生的，这种逆录酶是Temin 等在 70 年代初研究致癌RNA 病毒时发现的。该酶以RNA为模板，根据碱基配对原则，按照RNA 的核苷酸顺序合成DNA （其中 U 与 A 配对）。这一途径与

44、一般遗传信息流的方向.'.相反，故称反向转录或逆转录。携带逆转录酶的病毒侵入宿主细胞后，病毒RNA 在逆转录酶的催化下转化成双链cDNA ，并进而整合人宿主细胞染色体DNA 分子，随宿主细胞DNA 复制同时复制。这种整合的病毒基因组称为原病毒。在静止状态下，可被复制多代，但不被表达，故无毒性。一旦因某种因素刺激而被活化，则该病毒大量复制，如其带有癌基因，还可能诱发细胞癌变，后来发现逆转录酶不仅普遍存在于RNA 病毒中，而且哺乳动物的胚胎细胞和正在分裂的淋巴细胞也含有逆转录酶。逆转录酶的作用是以dNTP 为底物， RNA 为模板， tRNA （主要是色氨酸tRNA ）为引物，在Trna3

45、-OH 末端上，53方向，合成与RNA 互补的 DNA 单链，称为互补DNA （ cDNA ），单链 cDNA 与模板 RNA 形成 RNA-DNA杂交体。随后在逆转录酶的RNase H 活性作用下，将RNA 链水解成小片段。cDNA 单链的 3末端回折形成一个小引物末端，逆转录酶又以第一条cDNA 链为模板再合成第二第cDNA 链，至此，完成逆转录全过程，合成双链cDNA 。逆转录现在已成为一项重要的分子生物学技术，广泛用于基因的克隆和表达。从逆转录病毒中提取的逆转录酶已商品化，最常用的有AMV 逆转录酶。利用真核Mrna3末端存在一段聚腺苷酸尾，可以合成一段寡聚胸苷酸（oligo(dT)

46、）用作引物，在逆转录酶催化下合成互补于mRNA 的 cRNA 链，然后再用RNase H 将 mRNA 消化掉，再加入大肠杆菌的DNA 聚合酶 I催化合成另一条DNA 链，即完成了从mRNA 到双链 DNA 的逆转录过程。所得到的双链cDNA 分子经 S1 核酸酶切平两端后接一个有限制酶切点的接头（ linker ），再经特定的限制酶消化产生粘性末端，即可与含互补末端的载体进行连接。常用的克隆载体是噬菌体 DNA ，如 gt， EMBL 和 Charon 系列等。用这类载体可以得到包含104 以上的转化子的文库，再经前面介绍的筛选方法筛选特定基因克隆。用这种技术获得的DNA 探针不含有内含子序

47、列。因此尤其适用于基因表达的检测。（三） RNA 探针RNA 探针是一类很有前途的核酸探针，由于 RNA 是单链分子， 所以它与靶序列的杂交反应效率极高。早期采用的RNA探针是细胞mRNA 探针和病毒RNA 探针，这些 RNA 是在细胞基因转录或病毒复制过程中得到标记的，标记效率往往不高，且受到多种因素的制约。这类RNA 探针主要用于研究目的，而不是用于检测。例如，在筛选逆转录病毒人类免疫缺陷病毒（ HIV ）的基因组DNA 克隆时，因无DNA 探针可利用，就利用HIV 的全套标记mRNA 作为探针，成功地筛选到多株HIV基因组 DNA 克隆。又如进行中的转录分析（nuclear run on

48、 transcrip tion assay）时，在体外将细胞核分离出来，然后在-32P-ATP 的存在下进行转录，所合成mR NA 均掺入同位素而得到标记，此混合mRNA 与固定于硝酸纤维素滤膜上的某一特定的基因的DNA 进行杂交，便可反映出该基因的转录状态，这是一种反向探针实验技术。近几年体外转录技术不断完善，已相继建立了单向和双向体外转录系统。该系统主要基于一类新型载体pSP 和 pGEM ，这类载体在多克隆位点两侧分别带有SP6 启动子和T7 启动子，在SP6RNA 聚合酶或T7RNA 聚合酶作用下可以进行RNA转录，如果在多克隆位点接头中插入了外源DNA 片段，则可以此DNA 两条链中

49、的一条为模板转录生成RNA 。这种体外转.'.录反应效率很高，在1h 内可合成近10g的 RNA 产生，只要在底物中加入适量的放射性或生物素标记的NTP，则所合成的RNA 可得到高效标记。该方法能有效地控制探针的长度并可提高标记物的利用率。值得一提的是，通过改变外源基因的插入方向或选用不同的RNA 聚合酶，可以控制RNA 的转录方向，即以哪条DNA链以模板转录RNA 。这种可以得到同义RNA 探针（与 mRNA 同序列）和反义RNA 探针（与 mRNA 互补），反义RNA 又称 cRNA ，除可用于反义核酸研究外，还可用于检测mRNA 的表达水平。在这种情况下，因为探针和靶序列均为单链

50、，所以杂交的效率要比 DNA-DNA 杂交高几个数量级。 RNA 探针除可用于检测 DNA 和 mRNA 外，还有一个重要用途，在研究基因表达时， 常常需要观察该基因的转录状况。在原核表达系统中外源基因不仅进行正向转录，有时还存在反向转录（即生成反义 RNA ），这种现象往往是外源基因表达不高的重要原因。另外，在真核系统，某些基因也存在反向转录，产生反义RNA ，参与自身表达的调控。在这些情况下，要准确测定正向和反向转录水平就不能用双链DNA 探针，而只能用RNA 探针或单链DNA 探针。综上所述， RNA 探针和 cRNA 探针具有 DNA 探针所不能比拟的高杂交效率，但RNA 探针也存在易于降解和标记方法复杂等缺点。（四）寡核酸探针前述三种探针均是可克隆的，一般情况下，只要有克隆的探针，就不用寡核苷酸探针。在DNA 序列未知而必须首先进行克隆以便绘制酶谱和测序时，也常应用克隆。克隆探针一般较寡核苷酸探针特异性强，复杂度也高，从统计学角度而言，较长的序列随机碰撞互补序列的机会较短序列少，克隆探针的另一优点是，可获得较强的杂交信号，因为克隆探针较寡核苷酸探针掺入的可检测标记基因更多。但是，较长的探针对于靶序列变异的识别能力又有所降低