HPLC法测定对坐叶片中槲皮素的含量

1、HPLC法测定对坐叶片中槲皮素的含量周旭美，蓝英妮(遵义医学院药学系，遵义市 563003)摘要 目的：建立高效液相色谱法测定对坐叶片中槲皮素含量的方法。方法：用Dikma-ODS C18色谱柱（250 mm×4.6mm ，5µm），流动相为甲醇-0.4%磷酸溶液（53：47），流速为1.0ml·min-1，检测波长为370nm，柱温35。结果：槲皮素检测在1.31-9.17µg·ml-1的浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系（r=0.9998），平均加样回收率为97.81%，RSD为0.98（n=5）。结论：该方法用于测定对坐叶中槲皮素含量简便

2、、快速、准确，为建立对坐叶片的质量控制方法提供科学依据。关键词：对坐叶片 槲皮素 含量测定 高效液相色谱法 Determination of quercetin in Duizuoye Tablet by HPLCZhou Xu-mei, Lan ying-ne (Dept.of pharmacy,Zunyi medical college ,Zunyi 563003,China)Abstract Objective : To establish a method of HPLC determination of quercetin in Duizuoye Tablet. Method : H

3、PLC analysis was carried out on Dikma-ODSCI8 column(250 mm×46 mm，5µm) and the methanol- 0.4 phosphoric acid solution (53：47) as mobile phase，the flow rate was 1.0 ml·min-1, the detection wavelength was 370nm and the column temperature was 35. Results : The calibration curve was linear

4、 in the range of 1.319.17µg·ml-1 (r=0.9998). The average recovery was 97.81, with RSD of 0.98(n=5)Conclusion : The HPLC method is simple，rapid and accurate of the determination of quercetin in Duizuoye Tablet，and it can be used for the quality control of Duizuoye TabletKey word: Duizuoye T

5、ablet; quercetin ; determination ; HPLC对坐叶片是由对坐叶单味药制成的片剂，具有清热解毒，利湿止泻的功效，用于胃肠湿热所致的腹泻、腹胀、腹痛、里急后重以及痢疾、急性胃肠炎等症1。对坐叶来源于茜草科耳草属植物长节糙耳草Hedyotis uncinella Hook. et Arn. Var. scabridaOldenlandia uncinella （Hook. et Arn.） O. Ktunze var. scabrida （Franch.） Hand.-Mazz.，其主要功能是祛风利湿，健脾消积，清热解毒；用于风湿关节痛，小儿疳积，久泻，痢疾，牙疳；

6、外用治皮肤瘙痒，结膜炎2。对坐叶化学成分有齐墩果酸、槲皮素和熊果酸等3。质量标准是采用薄层色谱法测定齐墩果酸的含量，存在操作繁琐，灵敏度较低，误差大等缺点，本文选择槲皮素作为测定指标，建立高效液相谱法测定对坐叶片中槲皮素含量的方法，该方法目前尚未见报道。 1 材料与方法1.1 材料 高效液相色谱仪：岛津LC10ATVP高效液相色谱仪；检测器：岛津SPD10AVP紫外检测器；色谱柱：Dikma-ODS C18(250×4.6mm 5µm)；AUW120D电子天平（十万分之一，日本岛津公司）。槲皮素对照品（中国药品生物制品检定所提供，批号：100081-200406）；对坐叶片

7、（贵州某药厂，批号分别为20070701等）；色谱甲醇，其它试剂（盐酸、磷酸等）为分析纯。2 方法与结果2.1 色谱条件 色谱柱为Dikma-ODS C18(250×4.6mm 5µm)；流动相为甲醇-0.4%磷酸溶液（53 ：47）；检测波长370nm；流速为1.0ml* min-1；柱温35；进样量为20µl。2.2 测定溶液制备对照品溶液的制备 精密称取槲皮素对照品适量，加甲醇制成5µg·ml-1槲皮素溶液。2.2.2 供试品溶液的制备 取本品10片，研细混匀，取 1.0g，精密称定，置于磨口具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20ml、25%盐酸

8、溶液10ml，密塞，称定重量，水浴回流1.5h，放冷，称重，用甲醇补充减失重量，摇匀，滤过，精密吸取5ml续滤液置于25ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45µm）过滤，即得。2.2.3 阴性对照溶液的制备 按制备工艺方法制备不含对坐叶的阴性样品，再按上述供试品溶液制备的方法制备成阴性样品溶液。2.3 系统适应性 分别精密吸取槲皮素对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液各20l，注入高效液相色谱仪，记录图谱（见图1）。结果发现槲皮素对照品在某一保留时间内出峰，在供试品图谱上相同的保留时间内也出现和对照品同样的峰，且基线较平，与相近的杂质峰分离完全，无杂质峰干扰，阴

9、性对照溶液所得色谱图上相应保留时间无色谱峰出现，表明阴性样品溶液对测定无干扰.t/minA t/minB t/minCA对照品溶液；B.供试品溶液；C.阴性对照溶液图1 对坐叶中槲皮素含量测定HPLC图2.4 线性关系 精密称取槲皮素对照品13.1mg，加甲醇溶解并定容至100ml，摇匀，精密量取此溶液25ml，加甲醇稀释并定容至100ml，摇匀，制成浓度为32.75µg·ml-1的储备溶液；分别精密吸取储备溶液1ml、2ml、3ml 、4ml、5ml、6ml、7ml，置25ml容量瓶中，加流动相稀释并定容至刻度，摇匀；分别精密吸取上述溶液各20µl，注入高效液相

10、色谱仪，记录色谱图，以对照品浓度（µg·ml-1）为横坐标，测得峰面积积分值为纵坐标，进行线性回归分析，得回归方程：Y=31339X-8145.7，r=0.9998。2.5 精密度和稳定性取对照品溶液重复进样5次进行测定，结果RSD0.89%(n=5)，表明日内精密度良好。取同一份对照品溶液于0,1，2,3d测定，结果测得峰面积RSD1.39%(n=4)，表明日间精密度良好。取供试品溶液于0，2，4，6，8h后测定峰面积，RSD1.24%(n=5) ,结果表明在8小时内，供试品溶液中槲皮素的含量稳定。2.6 重复性试验 取同一批样品粉末（批号：20070701）5份，各约1

11、.0g，精密称定，按项下的方法制备5份供试品溶液，依法测定，测得槲皮素的峰面积RSD0.91%(n=5)，表明该方法重现性好。2.7 加样回收率实验 精密称取已知含量为538.70µg/g样品粉末5份，每份约0.5g，精密称定，分别精密加入槲皮素对照品溶液（365.20µg/ml）1ml，按按项下的方法制备5份供试品溶液，依法测定，计算回收率。结果见表1，表明该方法具有较好的回收率。表1 供试品溶液中槲皮素的加样回收率试验编 号样品称重量（g）样品中含量（µg）加入对照品量（µg）峰面积 测得量（µg） 回收率 （%）平均回收率 （%）R S

12、D （%）123450.50450.50130.50110.50160.5005 271.77270.05269.94270.21269.62365.20365.20365.20365.20365.20124211122536122505123543122037 633.51 625.49 625.34 630.31623.10 99.05 97.32 97.3198.60 96.7997.810.982.8 样品含量测定 分别精密称取10批对坐叶片样品，按按项下的方法制备供试品溶液，依法测定，计算该10批样品中槲皮素的含量，结果见表2。表2 样品含量的测定结果批号样品量（g）峰面积 测定值（

13、µg/g）平均含量值（µg/g）200707012007070220070703200707042007070520070706200707072007080120070802200708031.05331.07561.06991.06881.06911.08221.05521.07361.07431.0862111623112651110770113484111834113214113052112164113946114879544.25537.54 531.99 544.69 537.15 536.75 549.94 536.02 543.96 542.11 540.4

14、3结果表明10批样品的平均含量为540.43µg/g，每片片重规格为0.25g，平均每片含槲皮素135.11µg。3 讨论 对坐叶片原质量标准中采用薄层色谱法测定齐墩果酸含量1，方法繁琐，本文采用槲皮素作为待测成分，以HPLC法定量测定方法简便、结果可靠。根据参考文献2,3，4，考察了不同比例的甲醇-0.4%磷酸溶液作为流动相，只有在甲醇-0.4%磷酸溶液（53 ：47）时，槲皮素峰形最佳，吸收峰分离度好，保留时间适中。 槲皮素存在形式有游离型和槲皮素-3-阿拉伯糖苷，要先经水解为游离型后方可被提取和测定，本文采用加酸水解，水解条件选择实验中，分别加入了5%、10%、25%的盐酸溶液进行比较，结果表明加入5%、10%盐酸溶液，水解不完全，槲皮素含量低；而加入25%盐酸溶液水解完全，槲皮素含量高，故选用加入25%盐酸溶液。槲皮素溶于甲醇、乙醇，微溶于水，分别以甲醇、乙醇为提取溶剂进行比较，结果表明了甲醇提取比乙醇提取完全，含量较高。对样品水浴回流提取0.5h、1.0h、1.5h、2.0h进行比较，