Ro25-6981对成年脑缺血再灌注大鼠海马CA1区神经发生的影响

1、Ro25-6981对成年脑缺血/再灌注大鼠海马CA1区神经发生的影响         10-10-30 16:07:00     编辑：studa20                   作者：王姗姗，胡忠浩，徐铁军  【摘要】  目的 探讨NMDA受体亚单位2B选择性

2、拮抗剂Ro25-6981对成年大鼠短暂性全脑缺血再灌注后海马CA1区神经发生的影响。方法 将成年雄性SD大鼠随机分为实验组和对照组。制作四动脉阻断(4AO)大鼠全脑缺血15 min再灌注模型。实验组和对照组大鼠分别于术前30 min腹腔注射不同剂量Ro25-6981(0.3 mg/kg、0.6 mg/kg)、生理盐水。免疫组织化学技术显示再灌注第1、3、7天各组大鼠海马CA1区BrdU阳性细胞数。结果 对照组大鼠BrdU阳性细胞在再灌注3 d增殖达高峰，随后下降。 再灌注1、3、7天，实验组与对照组相比BrdU阳性细胞数均明显减少(P<0.01)。结论 一定条件下，Ro25-6981可抑

3、制缺血再灌注诱导的海马CA1区的短暂性神经发生。 【关键词】  脑缺血/再灌注;NMDA受体拮抗剂;神经发生;大鼠Abstract: Objective To investigate the effect of the selective antagonist Ro25-6981 of NMDA receptor subunit 2B (NR2B) on the neural recovery in adult rat hippocampus after transient forebrain ischemia/reperfusion (I/R). Methods The male

4、SD rats were randomized into three groups: the experiment groups (and ) and the control group. The rats in the experiment groups and the control group were subjected to 15 min of 4-artery occlusion (4AO) to establish the animal model of rat brain ischemia (15 min) and reperfusion. The rats in the ex

5、periment groups were intraperitoneally administered with Ro25-6981 at doses of 0.3 mg/kg and 0.6 mg/kg, respectively, while the same volume of NS was injected into the rats in the control group. Immunohistochemistry was employed to demonstrate and to compare the rate of BrdU positive cells in CA1 of

6、 hippocampus in different groups at 1 d, 3 d and 7 d. Results The control group: BrdU positive cells peaked at I/R 3 d and decreased until I/R 7 d in the CA1 region. The experiment groups: The numbers of BrdU-positive cells significantly decreased as compared to that in the control group. Conclusion

7、 Transient forebrain ischemia/reperfusion could induce neurogenesis in the CA1 region, while this kind of neurogenesis could be inhibited by Ro25-6981.Key words: ischemia/reperfusion; NMDA receptor antagonist; neurogenesis缺血性脑血管病是严重威胁人类健康的常见病和多发病。目前认为，当发生缺血缺氧时，刺激谷氨酸受体，尤其是引起NMDAR过度兴奋，导致神经细胞Ca2+超载而致损伤

8、1。于是人们试图使用NMDAR拮抗剂缓解脑缺血引起的神经细胞死亡。有研究表明NMDAR拮抗剂MK-801可刺激正常的成年大脑神经发生2-3。注射MK-801虽然可以防止短暂性局脑缺血后海马CA1区神经元的死亡，但同时也阻止了海马齿状回中缺血诱导的神经发生4。此外，NMDAR不仅在病理过程中起作用，也可能参与了众多的生理功能，使用NMDA受体拮抗剂会对其正常生理活动干扰过大。因此选择具有受体亚基选择性的拮抗剂，能够在较小剂量下产生定位靶向作用，减少副作用，提高安全性。海马CA1区在脑缺血时的相对易损性使其成为研究缺血性脑损伤的理想对象。本课题组以往实验发现，NR2B蛋白质和mRNA在正常大鼠海马

9、CA1区、CA3区及齿状回的免疫反应强度存在明显差异，CA1区最强，CA3区次之，齿状回着色较弱。这种基础性平行高表达可能是造成海马CA1区缺血易损性的原因之一5。那么，NMDA受体亚单位2B(NR2B)选择性拮抗剂Ro25-6981对脑缺血/再灌注(I/R)后海马CA1区的作用如何呢?本实验旨在研究其对脑缺血后海马CA1区神经发生的影响。1 材料和方法1.1 实验动物和分组 成年雄性SD大鼠(徐州医学院实验动物中心提供)36只，体重(250±25) g，随机分为实验组(n=24)和对照组(n=12)。实验组大鼠于术前30 min腹腔内注射不同剂量Ro25-6981(0.3 mg/k

10、g、0.6 mg/kg)，对照组在术前30 min注射等容量(5 ml)的生理盐水。大鼠分别在注射Ro25-6981或生理盐水后第1天、3天和7天各处死4只。所有大鼠于处死前1天在12 h内每4 h腹腔注射BrdU 50 mg/kg，共3次。1.2 前脑缺血/再灌注模型的制备 按照Pulsinelli的四血管阻断法进行：10%水合氯醛(0.350.4 ml/100 g)腹腔注射麻醉，从颈前分离出双侧颈总动脉,并分别套以丝线(不结扎)，再经第1颈椎双侧横突翼孔电凝灼断双侧椎动脉。24 h后，大鼠不予麻醉,直接仰置固定于手术台上，在清醒状态下用动脉夹同时夹闭双侧颈总动脉，15 min后松开动脉夹，

11、确认双侧颈总动脉再灌流后关闭切口。手术过程中持续进行肛温监测，并用白炽灯照射的方法维持大鼠体温恒定。符合以下条件的大鼠入选缺血再灌注组：动脉夹闭60 s内，大鼠翻正反射消失;双侧瞳孔持续开大，轻触条件下角膜反射消失;肛温稳定在3637范围内。1.3 切片制备 动物用10%水合氯醛(0.350.40 ml/100 g)腹腔注射麻醉，经心脏升主动脉插管，快速灌注80100 ml生理盐水后，再灌注4%多聚甲醛300 ml，前100 ml快灌，后200 ml慢灌，30 min内灌完。灌注后的大鼠断头、暴露脑，在立体定位仪上，将鼠脑冠状位分成前、中、后3段。取含有海马的中段放入4%多聚甲醛，过夜固定。脑

12、组织块自4%多聚甲醛取出后，进行梯度乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡、石蜡包埋。然后将脑块作连续冠状切片，片厚6 m，将每只大鼠海马的全部切片按相同间隔顺序分成3套(焦油紫染色1套、免疫组化1套，阴性对照1套)。1.4 焦油紫染色 脱蜡、复水;焦油紫染色，6 min;双蒸水洗，10 s;依次经过乙醇分色，时间依蓝化程度而定;脱水、透明、封片。1.5 免疫组织化学反应 切片用铅笔做记号，按下列步骤进行BrdU的免疫组织化学反应。反应步骤如下：梯度乙醇脱蜡、复水，PBS漂洗;3%H2O2处理10 min灭活内源性酶，双蒸水洗;切片于枸橼酸钠溶液中微波抗原修复：高火2 min，低火持续15 min，自然冷

13、却，PBS漂洗;加BSA封闭液37孵育箱，1 h;取后甩干，滴加BrdU小鼠单克隆抗体(1500，Sigma公司)，4过夜，PBS冲洗;37复温1 h;冷却至室温后，PBS冲洗，甩干后，加生物素化山羊抗小鼠IgG(武汉博士德)，37，30 min;冷却至室温后PBS冲洗;滴加试剂SABC(武汉博士德)，37，30 min;冷却至室温后，0.01 mol/L PBS冲洗，5 min×4次;DAB显色，显色时间以在显微镜下观察为准，及时终止反应;脱水，透明，封片。阴性对照切片用0.1% TritonX-100代替一抗孵育，其他反应步骤相同。1.6 图像分析 采用目镜带有网格尺(10 mm×10 mm)的显微镜(目镜10×