总黄酮总酚含量测定方法

1、太行菊的抗氧化活性试验计划1.实验内容对太行菊的甲醇提取物的乙醇、正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、水 共六种萃取物进行总酚、总黄酮含量的测定，分析实验结果，选择总分和总黄酮 含量比较高的两个层分进行抗氧化能力测定，分析其抗氧化能力强弱，判断其有 无研究价值。用Folin-Denis法测定太行菊甲醇提取物各萃取层组分的总酚含量，以没食子酸作为标准品进行对照。用三氯化铝法测定太行菊各萃取层组分的总黄酮含量， 以槲皮素作为标准品进行对照。根据实验结果，选择总酚和总黄酮含量较高的萃 取层组分进行抗氧化能力测定，包括DPPH自由基清除能力测定，羟基自由基清 除能力测定，还原能力测定。2实验步骤将太行

2、菊用甲醇溶液回流提取其有效成分，旋转浓缩后用水溶解，然后分别用正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取、水层，得相应层的馏分。2.1总酚含量测定：在试管中分别加入不同层样品（1mg/ml） 0,25ml +Folin-Denis 试剂0.5ml , 5 min后，再加入NazCOs饱和溶液0.5ml,并做三组重复。对照组中 样品和Folin-Denis试剂用DW代替，其他不变。空白组中 Folin-Denis试剂用 DW代替，其他不变。在760nm紫外光下测定吸光度。对实验结果处理后做标准曲线，以没食子酸为标准品。以没食子酸的微克数表示总酚含量：吸光度=0.0069卩g没食子酸0.042。Fol

3、in-Denis试剂的配制：在2L烧瓶中加入750ml蒸馏水，再加入100g钨酸钠 和20g磷钼酸，再加入50ml正磷酸回流2h,冷却后装入1L容器内置于暗处实验组*3 :体积Folin-Denis 的体积Na2CO3MEOH 层0.25ml0.5ml0.5mlH层0.25ml0.5ml0.5mlCH层0.25ml0.5ml0.5mlEA层0.25ml0.5ml0.5mlBUOH 层0.25ml0.5ml0.5mlW层122对照组*3 :DWDWNa2CO3体积 0.25ml0.5ml0.5ml空白组*3 :体积DW的体积Na2CO3MEOH 层0.25ml0.5ml0.5 mlH层0.25m

4、l0.5ml0.5 mlCH层0.25ml0.5ml0.5mlEA层0.25ml0.5ml0.5mlBUOH 层0.25ml0.5ml0.5 mlW层0.25ml0.5ml0.5ml2.2总黄酮含量测定:在试管中分别加入不同层样品(1mg/ml) 0.5ml+ 1MCH3COOK 溶液 0.1ml+ DW 2.8ml+95% 乙醇 1.5ml+10%AlCl 3 6H2O溶液0.1ml，并做三组重复。对照组中样品和 AlCl 3 6H2O溶液用DW代替，其他不变。空白组中 AlCl 3 6H2O溶液用DW代替，其他不变。所 配溶液在室温下放置40分钟后在510nm紫外光下测定吸光度。DW CH

5、3COOKDW95%乙醇DW对实验结果处理后做标准曲线，以槲皮素为标准品。以槲皮素的微克数表示总黄酮含量：吸光度=0.0066卩g槲皮素0.0357。实验组*3 :体积CH3COOKDW95%乙醇AlCl 3 6H2OMEOH 层0.5ml0.1ml2.8 ml1.5ml0.1mlH层0.5ml0.1ml2.8 ml1.5ml0.1mlCH层0.5ml0.1ml2.8 ml1.5ml0.1mlEA层0.5ml0.1ml2.8 ml1.5ml0.1mlBUOH 层0.5ml0.1ml2.8 ml1.5ml0.1mlW层0.5ml0.1ml2.8 ml1.5ml0.1ml对照组*3 :体积CH3C

6、OOKDW95%乙醇DWMEOH 层0.5ml0.1ml2.8 ml1.5ml0.1mlH层0.5ml0.1ml2.8 ml1.5ml0.1mlCH层0.5ml0.1ml2.8 ml1.5ml0.1mlEA层0.5ml0.1ml2.8 ml1.5ml0.1mlBUOH 层0.5ml0.1ml2.8 ml1.5ml0.1mlW层0.5ml0.1ml2.8 ml1.5ml0.1ml根据实验结果选择总酚和总黄酮含量较高的组分进行DPPH自由基清除能力测定、羟基自由基清除能力、还原能力的测定。体积 0.5ml0.1ml空白组*3 :2.8ml1.5ml0.1ml2.3DPPH（ 1,1-二苯基苦基苯肼

7、自由基）自由基清除能力的测定将总酚和总黄酮含量较高的两组样品配制成：1卩g/mL 5卩g/mL, 10卩g/mL,50 卩 g/m, 100 卩 g/mL个浓度对照组：0.5mL 0.2mmol/L的DPPH甲醇溶液+ 0.5mL试样溶剂（水）， 测试组：0.5mL 0.2mmol/L的DPPH甲醇溶液+0.5mL待测样品溶液，空白组：0.5mL样品溶液+0.5mL试样溶剂（水），混合均匀后室温下于暗处静置 30 min,然后在517 nm处测定吸光度。由下面的方程计算样品对DPPH自由基的清除能力：消除效率（%） =1-（Ai-Aj）/Ao X 100%2.4羟基自由基清除能力测定：抗氧化能

8、力是用Fe3+的螯合物（如Fe-EDTA）存在 下的Fenton型Haber-Weiss反应产生H0来测定的。将总酚和总黄酮含量较高的 两组样品 配制成：1卩g/mL 5卩g/mL 10卩g/mL 50卩g/mL, 100卩g/mL外浓度试管中依次加入100卩L的FeS04 7H2O、EDTA、2-脱氧核糖、100卩L各浓度的样品溶液（对照组加入100卩L样品溶剂水）、500卩L磷酸缓冲溶液，100 卩L H2O2于试管中，于37 °C水浴加热4小时。然后加入三氯乙酸（TCA）、二硫代 巴比妥酸（TBA ）各500卩L。之后将它们放在100 C恒温水浴锅中，冷却，3000 rpm，离

9、心5分钟。最后分别测定各样品在 532 nm下的吸光度，每个样品 的每个浓度重复3次。然后根据实验结果计算消除效率。消除效率（%） = （1-As/Ao） X100%其中：As为待测溶液的吸光度Ao为对照组溶液的吸光度2.5还原能力测定将总酚和总黄酮含量较高的两组样品 配制成50、100、200、500、1000卩g/mL 分别移取各浓度的样品1 mL于试管中加入磷酸盐缓冲液（pH=6.6） 2.5 mL，再加 入1%铁氰化钾溶液2.5 mL，在50 C下反应30 min。然后加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL充分混和均匀，3000 rpm下离心10 min。移取上清液2.5 mL于试管 中，

10、加入2.5 mL蒸馏水，再加入0.1 %三氯化铁0.5 mL，常温下反应5 min，然 后使用紫外可见分光光度计于 700 nm波长下测定吸光值。同时 做空白对照组， 不加样品，加入1 mL蒸馏水。每组实验重复3次。仅供个人用于学习、研究；不得用于商业用途For personal use only in study and research; not for commercial use.Nur f u r den pers?nlichen f u r Studien, Forschung, zu kommerziellen Zwecken verwendet werden.Pour l ' e tude et la rech