减毒沙门氏菌携带siRNASTAT3质粒对小鼠前列腺移植癌的治疗作用

1、减毒沙门氏菌携带siRNASTAT3质粒对小鼠前列腺移植癌的治疗作用         10-09-04 15:41:00     编辑：studa20           作者：刘喜东 周悦 周姝含 曹群 王芳 魏雁虹 周庆伟 赵雪剑【摘要】  目的 观察减毒沙门氏菌携带siRNASTAT3质粒对小鼠前列腺移植癌的治疗效果，分析其作用机制。方法 构建小鼠前列

2、腺移植癌模型，随机分组，将转化有siRNASTAT3质粒的减毒沙门氏菌经局部注射到模型构建成功的小鼠体内。观察小鼠一般状态，记录肿瘤体积的变化，RTPCR和Western bolt方法分析STAT3 及其下游基因Bcl2、cMyc、HiF1、cyclinD1的mRNA和蛋白表达水平，铺板法观察菌群分布，HE染色观察肿瘤的形态学变化，免疫组化检查STAT3、HiF1及PCNA蛋白表达情况。结果 小鼠前列腺移植癌模型构建成功，携带有siRNASTAT3质粒沙门氏菌治疗组移植性前列腺癌瘤体生长受到明显抑制，瘤重减轻；铺板法检测菌群分布显示减毒沙门氏菌具有嗜肿瘤特性且在肿瘤内长期存活；肝内分布次之，再

3、次为肺，在脾中分布最低；pGCSiSTAT3治疗组肿瘤组织的STAT3 mRNA和蛋白表达明显降低；其下游基因Bcl2、cMyc的mRNA及HiF1、cyclinD1蛋白的表达水平都不同程度的受到抑制；免疫组织化学结果显示pGCSiSTAT3治疗组肿瘤组织的STAT3、HiF1及PCNA表达下调。结论 以减毒沙门氏菌作为运载体携带siRNASTAT3质粒通过调控STAT3下游基因表达，诱导凋亡，对小鼠移植性前列腺癌具有显著的抑瘤作用。 【关键词】  前列腺癌；减毒沙门氏菌；STAT3；RNA干涉    【Abstract】  Objective

4、  To observe therapeutic efficacy of attenuated saimonella carrying the siRNAStat3 plasmid towards transplanted prostatic cancer of mouse. Methods  The prostatic transplanted model of mouse was built, then the attenuated salmonella with transformed plamid of siRNASTAT3 was injected into lo

5、cal bodies of mouse models constucted successfully. The general status of the mouse were observed and the changing volumes of tumors were recorded.Then the expression of mRNA and protein levels of STAT3 and its downstream genes such as Bcl2,cMyc, HiF1,cyclinD1 were analyzed by RTPCR and Western blot

6、, apoptosis of tumor cells was tested by Flow cytometry.Results  (1)Prostatic trnasplanted cancer mondel of mouse were made successfully,and the growth of tumors in the group treated with salmonella of siRNASTAT3 plasmid were suppressed obviously and the weights of tumors were lessened;(2)The a

7、poptotic rates of the cancer group treated with pGCSiSTAT3, pGCSiScramble and group mock were 29.1%,14.7% and 8.5%, respectively. (3)The mRNA and protein expressions of STAT3 in the tumor tissue treated with pGCSiSTAT3 were decreased greatly.The mRNA expressions of downtream genes, such as BcL2,cMyc

8、 were inhibited in a different degree, and the protein expressions of HiF1, cyclinD1 were just the same. Conclusions  Regulating expression of STAT3 to induce apoptosis by means of plasmid of siRANSTAT3 with the transporter of attenuated salmonella could suppress the transplanted prostatic canc

9、ers of mouse.    【Key words】  Prostatic cancer; Attenuated salmonella; STAT3; RNA interfere信号转导和转录活化因子(Signal Transducer and Activator of Transcription，STATs)家族是一种存在于胞浆并在激活后能够转入核内与DNA结合的蛋白家族，具有信号转导和转录调控双重功能。在正常情况下，STAT信号途径的激活是一个瞬时的过程，并受严密调控，其持续激活则与细胞的恶性转化进程密切相关1。在不同类型的肿瘤中，激活的STAT

10、家族成员并不完全相同，其中STAT3与肿瘤的发生发展关系最为密切，目前公认为它是癌基因。STAT3并不直接导致肿瘤的发生，而是通过对其下游靶基因的调控来影响肿瘤的进程。STAT3的下游靶基因如 BclXL、Bcl2、Mcl1、CyclinD1、cMyc、cJun、Fas和VEGF等都与细胞增殖与凋亡密切相关2。本实验以小鼠移植性前列腺癌为模型，以减毒沙门氏菌作为载体，携带siRNASTAT3质粒，观察其对小鼠前列腺癌的治疗效果，探索其作用机制。1  材料与方法1.1  动物、试剂及仪器健康雄性C57BL/6近交系小鼠30只，鼠龄10 w，体重2024 g，由吉林大学动物中心

11、提供；减毒鼠沙门氏菌phoP/phoQ突变株及携带有SiSTAT3质粒（人鼠同源）S.Typhi Ty21a人用疫苗株由吉林大学中日联谊医院前列腺疾病预防和治疗中心提供；前列腺癌M1细胞株购自上海细胞所；DNA Marker DL2000，1 kb Ladder DNA Marker均为Takara公司产品。引物合成及测序由上海生工生物工程技术服务公司完成。高保真Taq DNA聚合酶、二氨基联苯胺（DAB）、曲拉通（Triton）X100、dNTP、逆转录酶及质粒提取和纯化试剂盒购自Promega公司；兔抗人STAT3一抗、羊抗兔辣根过氧化物酶标记的二抗购于Santa Cruz公司；RNA酶购

12、于美国Ambion公司。Trizol(Invitrogen公司，美国)；超净工作台（YZ875苏州净化设备厂）；电泳仪（Biorad，美国）；凝胶成像系统（上海天能科技有限公司）；全自动显微镜数码摄像系统、相差显微镜、荧光显微镜（OLYMPUS，日本）；流式细胞仪(美国）；PCR扩增仪（GeneAmp，美国）；自动CO2恒温培养箱（SANYO，日本）；蛋白质电泳装置及转移系统（Biorad，美国）。1.2  小鼠前列腺癌移植模型的建立 取对数生长期的小鼠前列腺癌RM1细胞，用胰酶消化后配制成细胞浓度为5×106 个/ml的悬液，取0.2 ml注射于雄性C57BL/

13、6小鼠腋下，2 w开始成瘤，3 w后肿瘤生长至直径1 cm大小时备用。将肿瘤组织取出，放置在低温、无菌的0.9%生理盐水中，在10倍显微镜下切割成直径(1.2±0.2) mm大小的肿瘤块。再取体重2024 g的雄性C57BL/6小鼠，用1%戊巴比妥钠0.1 ml行腹腔注射麻醉。剪开小鼠背部皮肤，将切好的瘤块嵌入皮下。并用80外科无创缝线缝合，待小鼠苏醒后放回笼中。1.3  实验动物分组及给药取术后10 d手术成功的前列腺癌移植瘤模型小鼠30只，随机分为Mock未治疗组，pGCSiScramble组，pGCSiSTAT 3组，每组10只。将含质粒的沙门氏菌分别接种于含Kana

14、的LB平板（50 mg/L）和含Amp的LB平板（50 mg/L），倒置平皿37培养1620 h，分别挑菌接种于200 ml含Kana和含Amp的LB培养液中， 置于37恒温摇床，测A值为0.6时停止培养。每组肿瘤局部注射携带相应组质粒的减毒沙门氏菌，分2点注射，每点50 l，细菌浓度为109 cfu/100 l，在治疗后隔日1次用精密卡尺测量肿瘤最大长径和短径，并计算肿瘤体积，观察肿瘤体积的变化。体积0.52×长径×短径2。1.4  将重组质粒电转化入鼠减毒沙门氏菌phoP/phoQ突变株 用枪头挑取单克隆phoP/phoQ菌菌落，制备感受态细胞。利用

15、电转化的方法将重组质粒转入鼠减毒沙门氏菌phoP/phoQ 突变株。1.5  铺板法检测菌群分布 铺板为无菌状态下取肿瘤、脾脏、肝脏和肺脏各40 mg，以2 ml冷的磷酸盐缓冲液（PBS）研磨后稀释10倍，取500 l接种到含Amp的LB平皿，37过夜，次日观察形成的单个克隆数进行定量分析。1.6  肿瘤病理组织学观察 取肿瘤组织作病理切片，苏木素伊红（HE）染色观察肿瘤组织的病理变化。STAT3、缺氧诱导因子1(HIF1)、增殖细胞核抗原(PCNA)免疫组织化学染色。组织切片脱蜡后水洗，蒸馏水洗，PBS洗。3% H2O2温育10 min后自来水充分水洗

16、，蒸馏水洗，PBS洗。热抗原修复或消化，将切片置入抗原修复液，用微波炉加热至沸腾1020 s，PBS充分洗。加正常血清封闭20 min，弃血清后直接加兔抗鼠STAT3、HIF1、PCNA一抗1500，室温1 h，PBS充分洗。加12 000稀释的羊抗兔辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育30 min，PBS充分洗，DAB显色，电子显微镜观察在肿瘤细胞质内出现棕黄色颗粒，且着色强度高于背景非特异性染色者判定为阳性。1.7  肿瘤组织基因及蛋白质水平检测  Trizol法提取总RNA及逆转录反应：用Trizol 试剂提取肿瘤组织RNA,用紫外分光光度计测量OD260和OD280，

17、计算OD260/OD280的比值，留取比值在1.82.0的样本进行逆转录。RNA定量：RNA 浓度（g/ml）=OD260×40×100，取10 g总RNA,Oligo为引物进行逆转录。PCR (Polymerase Chain Reaction)：应用小鼠actin 引物进行PCR，鉴定 cDNA模板质量。actin 引物序列：正义5CTGGGACGACATGGAGAAAA3；反义5AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC3，扩增片段600 bp； PCR条件：94变性3 min， 94变性30 s， 55退火30 s，72延伸30 s， 30个循环，最后72延伸5 mi

18、n。扩增产物经1% 琼脂糖凝胶电泳后经凝胶成像系统拍照。    应用小鼠STAT3 引物进行PCR，STAT3引物序列：正义5TTGCCAGTTGTGGTGATC 3；反义5AGACCCAGAAGGAGAAGC 3，扩增的目的片段为315 bp；PCR条件：94 30 s，55 30 s，72 1 min，30个循环后72延长5 min。应用小鼠Bcl2引物进行PCR，Bcl2引物序列：正义5ACTTGACAGAAGATCATGCC 3；反义5GGTTATCATACCCTGTTCTC 3，扩增的目的片段为585 bp；PCR条件：94 60 s，60 60 s，72 60 s，30个循环后72延长5 min。