宫颈糜烂脱落细胞IL-8表达的半定量研究

1、    宫颈糜烂脱落细胞IL-8表达的半定量研究张仙鹤王晶牛战琴张开明中国图书分类号R711.32R392.12摘要目的：探讨IL-8与宫颈炎症的关系。方法：采用RT-PCR法对糜烂及正常宫颈的脱落细胞和血清IL-8进行测定。结果：发现患者与正常人的宫颈脱落细胞IL-8扩增后均为阳性，经模板稀释后患者阳性率为73%，正常为21%，差别显著，但血清IL-8测定无明显差异。结论：认为IL-8在宫颈炎症中起重要作用。关键词宫颈糜烂IL-8基因扩增术Semiquanitatilly study of IL-8 gene expression in exfolia

2、tive cells of cervical erosionZHANG Xian-He，WANG Jing,NIU Zhan-Qin et al.Department of Obstetrics and Gynecology,the First Hospital,Shanxi Medical University,Taiyuan 030001AbstractObjective:To investigate the relationships between IL-8 level and cervical erosion.Methods:RT-PCR was used to study the

3、difference of IL-8 gene expression in cervical exfoliative cells and in sera from patients with cervical erosion and normals.Results:After template dilution,positive IL-8 gene expression in exfoliative cells of patients with cervical erosion was 73% and normal controls 21%,the difference is signific

4、ant.But there is no difference of IL-8 levels in sera from both groups.Conclusion:IL-8 is significant in the cervical erosion.Key wordsCervical erosionIL-8Gene proliferation已发现正常及病理状态下的宫颈组织中均含有大量的中性粒细胞，IL-8对其具有强烈的趋化及激活作用，为了解IL-8在有炎症的宫颈及正常的宫颈细胞表达有无差异、我们采用模板稀释RT-PCR法对22例宫颈糜烂患者及24例正常人的宫颈脱落细胞进行了IL-8半定量研

5、究，同时对血清中IL-8含量进行了测定。1材料与方法1.1检查对象病例取自1995年8月至1996年2月山西医科大学一院妇产科门诊及住院患者共22例。年龄2354岁，平均34岁。宫颈糜烂度6例、度9例、度7例。病期短则1月，长则1年。主诉白带量多者11例。血性白带者5例、接触出血者4例、下腹痛者2例。取材用0.5 cm宽竹刮板，在窥阴器暴露宫颈，发现糜烂部位后轻轻刮取，将刮取物置于盛有500 l中性缓冲甲醛液的离心管中摇动数次，使所取标本充分沉入管中，离心备用。对照组为无明显宫颈糜烂的正常体检者24例，其中22例为与同患者一起扩增时选择的配对正常人，年龄与配对患者相差不超过5岁。1.2主要试剂

6、及设备血清IL-8检测试剂盒(购自美国Genzyme公司)、酶标仪(芬兰Labsystems)、IL-8 引物(为Zymed公司产品，引物序列从5"端至3"端为ATGACTTCCAACCTGGCCGTG和TTATGAATTCTCAGCCCTCTTCAAAAACTTCTC)、AMV反转录酶、Taq酶、RNasin(为Promega公司产品)、dNTP(Sigma产品)、琼脂糖(国产)、基因扩增仪(美国MJ-PTC-100扩增仪)。1.3方法血清IL-8测定采用多抗ELISA法，主要步骤为IL-8单克隆抗体包被板，加待测血清，洗板后再依次加入抗IL-8多抗，辣根过氧化酶标记二抗

7、及底物液，最后用终止液，酶标仪450 nm及650 nm(双波长法)处，测光度A值，最后由标准曲线求得IL-8含量(单位pg/ml)。基因扩增法采用RT-PCR技术。主要步骤为将标本以12 000 r/min离心10 min，蛋白酶K消化20 min，以异硫氰酸-酚-氯仿方法从裂解液中提取总RNA，约取2.5 g RNA再反转录合成cDNA，取cDNA液2.5 l、TaqDNA聚合酶2 l、引物0.5 l、RT-buffer及dNTP进行PCR扩增(美国MJ-PTC-100)，总反应体系为25 l，cDNA变化温度为94变性1 min后，94 45 min、60 45 min、72 1 min

8、共30个循环，72 7 min，每次扩增均用蒸馏水代替标本作反应体系阴性对照。扩增产物鉴定：取5 l扩增物，加入1.5%琼脂糖胶进行电泳，溴化乙锭染色，于台式紫外线透射，反射分析仪观察结果，其扩增片段为302 bp，使用Hae型DNA限制性内切酶(Sigma公司产品)进行内切作为DNA标准对照物，酶切产物分别为132 bp和170 bp两个片段。取4例扩增结果阳性的正常对照组扩增物10 l，用纯水进行梯度稀释至PCR扩增结果为阴性，以此稀释度为标准临界稀释度，将其余所有扩增产物作为模板对其进行稀释，取稀释液5 l及引物、聚合酶、反应液等，再进行PCR扩增，总反应体系、扩增条件及观察均同前。1.

9、4统计学处理血清IL-8测定结果采用两样本均数t检验。2结果22例患者及24例对照者宫颈脱落细胞IL-8正常扩增结果均为阳性，但模板稀释后扩增结果为患者组16例阳性(73%)，对照组5例阳性(21%)，两组有明显差异，见图1；血清IL-8测定结果患者组含量±s为23.8±17.6 pg/ml，对照组为21.3±18.2 pg/ml，两组比较无明显差异(P0.05)，见图2。  图1正常人及患者宫颈细胞IL-8阳性例数的比较Fig.1Comparison of the positive examples of IL-8 in normal per

10、sons with patients  图2正常人及患者血清IL-8含量比较Fig.2Comparison of the IL-8 content in serum between normal persons and patients3讨论关于IL-8在妇产科方面对宫颈作用的研究国外已有报道，多认为与宫颈成熟、宫颈扩张、抗感染以及不孕有关等1-8。EI Maradny等的资料表明IL-8能使宫颈以类似于正常生理过程成熟的因素之一2。Schulte等研究细菌侵入人类上皮细胞的不同分泌现象时指出，宫颈上皮细胞(Hela细胞)分泌的IL-8是防止细菌入侵的一道防线3。Osmer

11、s等在剖腹产中取子宫下段活检，发现IL-8在宫颈扩张过程中扮演着重要的角色4。Kanayama等的实验表明尿胰蛋白酶抑制剂(UTI)能抑制IL-8诱导宫颈的成熟5。EI Maradny等对连续的宫颈组织(经过IL-1处理后)发现中性白细胞增多，又发现经过治疗的宫颈IL-8明显增高6。Maradny等在了解宫颈中硫酸脱氢表雄酮(DHA-S)对IL-8的作用时指出IL-8是由宫颈激素调节，DHA-S对其有协同作用7。我们对患者宫颈脱落细胞IL-8表达的半定量研究和IL-8血清含量的测定做了初步研究，22例宫颈糜烂和24例正常成熟的宫颈脱落细胞IL-8正常扩增结果均为阳性，经模板稀释后扩增结果为患者

12、组73%阳性、对照组21%阳性，两组差异明显，实验选择患者轻、中、重度每种例数接近，故结果有代表性，IL-8与炎症反应有密切关系，是一种重要的炎症和免疫调节物质，是机体免疫功能反应的表现。Sagawa等对239例病人采用免疫荧光测试盒进行细胞激动素粒细胞弹性蛋白酶检测结果，这类细胞激动素包括IL-8与抵抗阴道的感染上行防御机制有关，这与我们的结论一致8。 我们还对患者组与对照组做了血清测定，显示两组IL-8含量无明显区别(P0.05)，提示我们对宫颈糜烂患者结果应作为局部炎症反应去认识，是宫颈免疫反应的结果，未能引起全身免疫反应，推测IL-8的释放主要是在靶器官中，即宫颈上皮细胞。EI Mar

13、adny等发现经过治疗的宫颈IL-8明显升高，这个结论与我们的实验以及其他研究均有不同，有待今后进一步研究3，6，8。作者简介：张仙鹤，女，54岁，副教授，主要从事宫颈疾病研究；张开明，男，42岁，主任医师，主要从事免疫学实验室工作作者单位：张仙鹤王晶牛战琴(山西医科大学第一医院妇产科，太原030001)张开明(太原市中心医院免疫室，太原030009)4参考文献1Naz P K,Butler A.Interleukins-6 and 8 levels in sera and cervical mucus of fertile,idiopathic infertile and immumoinf

14、ertile women implication in infertility.Am J Reprod Immunol，1996；35(6)：5342EI Maradny E,Kanayama N,Halim A et al.Biochemical changes in the cervical tissue of rabbit indued by IL-8,IL-1,dehydroepiandrosterone sulphate and prostaglandin E2 a comparative study.Hum Reprod，1996；11(5):10993Schulte R,Watt

15、iau P,Hartland E L et al.Differential secretion of interleukin-8 by human epithelial cell lines upon entry of virulent or nonvirulent yersinia enterocolitica.Infect Immun，1996；64(6):21064Osmers R G,Adelmann B C,Rath W et al.Biochemical events in cervical ripening dilatation during pregnacy and pertu

16、rition.J Obstet Gynaecol，1995；21(2):1355Kanayama N,Maradny E I,Halim A et al.Urinary trpsin inhibitor suppresses premature cervical ripening.Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol，1995；60(2):1816EI Maradny E,Kanayama N,Halim A et al.The effect of interleuk-1 in rabbit cervical ripening.Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol，1995；60(1):757Maradny E,Kanayama N,Maehara K et al.Dehydroepiandrosterone sulfat