微卫星DNA标记对5个中外黄牛品种_群体遗传结构的研究

1、吉林农业大学学报2000,22(4):510JournalofJilinAgriculturalUniversity微卫星DNA标记对5个中外黄牛品种/群体遗传结构的研究吴伟1王栋1曹红鹤2(1.吉林农业大学动物科技学院长春130118;2.100094)摘要:利用4种微卫星DNA、×南阳牛杂种5个品种/,在此基础上又进行了聚类分析。关键词:DNA;黄牛;遗传结构中图分类号:S823.8文献标识码:A文章编号:100025684(2000)0420005206GeneticStructureofFiveChineseandForeignCattleBreedsUsingMicrosa

2、telliteDNAMarkersWUWei1,WANGDong1,CAOHong2he2(1.FacultyofAnimalScienceandTechnology,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China;2.InstituteofAnimalHusbandry,AgriculturalScienceAcademyofChina,Beijing100094,China)Abstract:Geneticstructureincludinggenefrequency,heterozygosity(H),polymorphisminfor

3、2mationcontents(PIC),numbersofeffectivealleles(Ne)andgeneticdistanceswerestudiedinfivecattlebreeds,namelyNanyang,Yanbian,Hanwoo,SimmentalandPiemontese×Nanyang,usingfourmicrosatelliteDNAmarkers.Clusteranalysiswasconductedbasedonmicrosatellitepolymorphism.GeneticrelationshipsbetweenChineseandfore

4、igncattleandbetweenBosandcommonbreedswerestatedatmolecularbiotechniquelevel.Keywords:microsatelliteDNA;marker;cattle;geneticstructure近年来,由于国内一些地方过度追求肉牛的经济效益,盲目引进高度培育的品种滥用杂交,使国内黄牛品种的数量日趋减少以至于濒临消亡,许多宝贵的基因也将随之丢失。任何一个品种都是一座宝贵的基因库,对国内外黄牛品种资源进行调查、研究、保护及合理利用已是一项刻不容缓的工作。当前分子生物技术的飞速发展,为品种资源多样性的研究和保护提供了最好的契机。

5、遗传标记技术为品种多样性的研究做出了很大贡献。如Medjugorac5用生化多态性标记分析欧洲14个牛品种的遗传结构,Peelman6和Martin7用微卫星标记法对国外不同牛品种进行了遗传分析。国内学者曹红鹤等1,2用蛋白质多态性作为遗传标记,对国内20余个黄牛品种进行了遗传结基金项目:“九五”农业部重点科研计划资助项目作者简介:吴伟,男,1950年出生,硕士,副教授,研究方向:动物遗传育种收稿日期:2000208220© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserve

6、d. 6吉林农业大学学报2000年构分析,比较了中国黄牛与周边国家黄牛品种的异同。目前国内采用更精确的分子遗传标记微卫星DNA标记,对中国黄牛与外国黄牛的遗传关系的研究尚未见报道。本文利用微卫星DNA作为遗传标记,研究中外5个黄牛品种的遗传结构,旨在从分子水平上探讨中国黄牛与外国黄牛、瘤牛与普通牛的遗传多态性,为黄牛品种资源的深入研究及保存和利用提供重要依据。dNTP、TEMED、BindingSalution、Sigmalote、100bpLadderDNA,4种微卫星DNA引物(见表1)由意大利国家研究委员会(CNR)和动物种质资源保存利用研究所(IDVGA)实验室提供。112方法1121

7、1基因组DNA的提取方法具体方法参1材料与方法111材料11111试验牛品种本试验共采集了延边牛、南见文献3。11212基因组DNA浓度及纯度检测以DNA/EcoR+Hind作分子量标记,用018%琼脂糖凝胶电泳分析,经EBDNA、,来阳牛、西门塔尔牛、韩牛、皮埃蒙特牛×种5个品种/群体的血样11112酶K、甲叉胺分子量标记物(EcoR+Hind)、限制性内切酶Hap、CNR、IDV24DNA引物,并利用他们提供的Cosmid克隆的PCR产物做标准,来判断等位基因的大小。4种微卫星DNA引物PCR反应条件见表1。表14种微卫星DNA引物及PCR反应条件Table1.Thedataof

8、fourmicrosatellitesandconditionsofPCR微卫星DNA引物重复单位Repeat产物/bpProductsMicrosatellite引物序列)Primer(53CCTTCTGGCAACCACCTATTTGTCCACCTAAGTGTCTCCTGATGGATGGTCAGTCACAGAGAAGCACAGGAAAGCCTGGTACTCATGGAATAGGGAGAATGGATGGAACCAAATTTCGAAGACGGGCAGACAGGAAATCCTTTCAAGTATGTTTTCAACTCACTCCAGTATTCTTGTCTGMg2+浓度染色体位置(/nmolL-1)Loc

9、ality.退火温度t/AnnealingtemperatureMg2+concentration115IDVGA-11(AC)192308q1460IDVGA-27(AC)101383q3711560IDVGA-44(AC)1921119q2211060IDVGA-46(AC)1120519q1611550PCR扩增程序:94预变性3min94变性30s退火45s72延伸45s,共35个循环,反应结束后72延伸10min。扩增产物的电泳及染色:先用115%琼脂糖凝胶检查PCR扩增效果,将扩增效果好的再用7%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进一步分析。电泳:向PCR扩增产物中加入4Lstoploadin

10、gDye,95变性3min。关闭电源,加样4L,用电泳仪(1700V,50W电泳2215h。染色:参照曹红鹤4方法进行。11214数据的统计分析采用PHLIP软件计算了遗传距离、平均杂合度并聚类,另用DISPAN软件再次进行了聚类分析,用QBASIC程序计算了每个位点的群体杂合度、有效等位基因数和多态信息含量,公式略。2结果与分析211基因组DNA提取从冻血中提取的DNA用018%琼脂糖凝胶电泳分析,然后在紫外灯下观察,结果见图1。图中M代表Marker,17为提纯的DNA。从图谱上看,基因组DNA的纯度和质量较好。© 1994-2009 China Academic Journal

11、 Electronic Publishing House. All rights reserved. 第22卷第4期吴伟等:微卫星DNA标记对5个中外黄牛品种/群体遗传结构的研究7207/211的杂合体;第2条带为207/207的纯合体;第3,9条带分别为215/221及209/211的杂合体。图1基因组DNA琼脂糖凝胶电泳结果Fig.1.ThepatternofgenomeDNAinagarosegelelec2tropheresisM:2DNA/EcoR+Hindmolecularweightmarker212微卫星DNA的PCR扩增2IIDVGA-44对4个微卫星DNA位点的PCR分别用

12、7%,PCR,GA-442)。从图2,第1,4,5,6,8和10条带为DNA的多态性21311微卫星位点等位基因频率4个微卫星位点的等位基因分布及其频率分别见表25。表2微卫星IDVGA-11的等位基因分布及频率Table2.AllelesdistributionandfrequenciesofmicrosatelliteIDVGA-11品种Breeds等位基因AllelesnN2140000010213218001010901025001036602200010326010167001010622201156301043501116700104262240109380116300109170

13、1036601053322601020801062501008301036601053322801354201337001408301280501340523001145801326101325001426801340523201229201021700118290111712340001008300101062360000010106南阳牛Nanyang6886104846604147延边牛Yanbian韩牛Hanwoo西门塔尔牛Simmental杂种牛Crossbreed注:n为各品种/群体该位点的等位基因数;N为各品种/群体的样本含量Note:n:numbersallelegeneoft

14、helocalityinthebreedsorpopulation;N:samplenumbersofbreedsorpopulation从表2可见,在IDVGA-11位点测定了242头牛,共发现11个等位基因,变异范围在214236bp之间,其中等位基因214和236仅见现10个等位基因,其变异范围为203221bp,其中以等位基因207,209,211的频率最高;同时等位基因219和221仅见于杂种牛,韩牛变异范围相对较小(表4)。在位点IDVGA-46,检测了265个个体,共发现10个等位基因,其变异范围为201237bp,其中以等位基因205,207的频率为最高;等位基因233和237

15、仅见于西门塔尔牛,219仅见于南阳牛,该位点在延边牛和韩牛中变异较小(表5),这说明延边牛和韩牛相对较纯。于杂种牛中,分析可能来源于皮埃蒙特牛,同时在该位点南阳牛和西门塔尔牛的变异性较小。在位点IDVGA-27,检测262个个体,共出现了6个等位基因,变异范围为132142bp。在这个位点上,延边牛和韩牛变异性较低,同时132仅见于南阳牛中,可能为南阳牛所特有(表3)。在位点IDVGA-44,检测281个个体,共发© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 8

16、吉林农业大学学报2000年表3微卫星IDVGA-27的等位基因分布及频率Table3.AllelesdistributionandfrequenciesofmicrosatelliteIDVGA-27品种Breeds等位基因AllelesnN13201010400001340129160141301608301166701242413601041700011533011380162500142400126670136671400000114000142010313011630011250011733012727南阳牛Nanyang533554846607533延边牛Yanbian韩牛Hanwo

17、o西门塔尔牛Simmental杂种牛Crossbreed表4IA-44smicrosatelliteIDVGA-44品种Breeds等位基因Alleles2030010109001050002050114610001006202070152070140220143330115000134052090117700120650118330125620117022110108320131520131670140000130852130103130001043801010621500001093801095721701041701065201066700101062190000010213221000

18、0010426南阳牛Nanyang654784846608047延边牛Yanbian韩牛Hanwoo西门塔尔牛Simmental杂种牛Crossbreed表5微卫星IDVGA-46的等位基因分布及频率Table5.AllelesdistributionandfrequenciesofmicrosatelliteIDVGA-46品种Breeds等位基因AllelesnN2010101040000101142030105210000103402050127080179340182500165670138642070136460119570115830121640139772090010109010

19、167010224010227211012396000011364217010417000010114219010208000023300001007502370000109700南阳牛Nanyang733574846606744延边牛Yanbian韩牛Hanwoo西门塔尔牛Simmental杂种牛Crossbreed21312微卫星位点的群体杂合度、多态信息含量、有效等位基因数由相应公式计算得到群体杂合度、多态信息含量、有效等位基因数,结果见表6。就各位点来说,IDVGA-11的群体杂合度、多态信息含量、有效等位基因数这3项数据最高,而IDVGA-46的最低,说明4个位点中ID2VGA-11

20、变异最大,IDVGA-46变异最小;从品种来看,杂种牛的各项指标最高,韩牛的最低,这说明韩牛相对最纯,而杂种牛的变异最大。© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 第22卷第4期吴伟等:微卫星DNA标记对5个中外黄牛品种/群体遗传结构的研究9表64个微卫星位点在各品种/群体中的有效等位基因数(Ne)、多态信息含量(PIC)、群体杂合度(H)Table6.TheNumbersofeffectivealleles,polymorphisminformationc

21、ontentandheterozygosityoffourmicrosatellitelociineachbreeds/population品种位点LocusBreeds平均值西门塔尔牛Simmental31352201660601701741248201017646318256017139017386210489014715015119南阳牛NanyangNe412947017590017671210899015198015215101016666317221017112017313延边牛Yanbian319328017202017457216531016231016231316696016

22、919114972012839013321韩牛Hanwoo31385201669101704621189201016545016739114165012599012940杂种牛Crossbreed3193890171540174613101319725017360017483310487016242016719Mean317808017049017330218488016217016070314218016823017039213467014701015082IDVGA-11PICHNeIDVGA-27PICHNeIDVGA-44HNeIDVGA-46PICH214品种/群体间遗传距离和聚类分

23、析(Cluster)根据遗传距离公式计算出中外5个黄牛品种的遗传距离(表7)。从遗传距离数值可看出,距离最近的是韩牛和延边牛,其次是西门塔尔牛和延边牛,西门塔尔牛和南阳牛间的距离最远。杂种牛含有1/2的南阳牛血液,但是它同南阳牛之间的距离却比韩牛与延边牛间距离及西门塔尔牛与延边牛间的距离中的任何1个都远,这可能与杂种牛的父本与母本间遗传距离相差太远(1个是欧系牛,一个是中国型瘤牛)有关。利用表7中遗传距离数据,用PHYLIP软件中的NJ法对5个品种/群体进行聚类分析,同时用DISPEN软件的NJ法再次聚类并进行Bootstrap检验,聚类结果见图3、图4。表7据微卫星多态性得出的品种/群体间标

24、准遗传距离Table7.Standardgeneticdistancesbetweenbreeds/populationbasedonmicrosatellitepolymorphisms品种Breeds南阳牛Nanyang0012364012989013519011307延边牛Yanbian韩牛Hanwoo西门塔尔Simmental杂种牛Crossbreed南阳牛Nanyang延边牛Yanbian001025001097601106300115660116670011135韩牛Hanwoo西门塔尔Simmental杂种牛Crossbreed在PHYLIP软件中由NJ法得到的聚类图(图3)看出

25、:延边牛和韩牛聚为一类(第2类),南阳牛和杂种牛聚为一类(第1类),这两类最后再与西门塔尔牛聚为一类。同时还看出西门塔尔牛与第2类的距离更近一些。由DISPAN软件中NJ法得到的聚类图(图4)看出,延边牛和韩牛聚为一类,然后与西门塔尔牛聚为一类。而南阳牛和杂种牛则自成一类。© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 10+-Nanyang+-1!+Crossbreed!+Yanbian-3-2!+-Hanwoo!+-Simmental吉林农业大学学报2000年

26、和PIC值很高,是可以理解的。312群体间遗传变异群体间遗传距离是遗传变异的尺度。从遗传距离数值看,南阳牛和其它品种间的距离都很远,说明瘤牛与普通牛之间遗传关系较远。西门塔尔牛、延边牛、韩牛的遗传距离较近说明它们同属于普通牛。延边牛和韩牛的遗传距离最近,证明了延边及韩国学者一致认为的延边牛与韩牛源于一支,只是由于地理隔离、人工选择等原因形成了2个不同的品种。图3由NJ法得到的基于微卫星多态性的聚类图(PHYLIP)Fig.3.DendrogramwithNJbasedonmicrosatellitepoly2morphisms(PHYLIP)55,这些结果可,同,可为延边牛开拓国际优质肉牛市场

27、提供重要依据。4小结图4由DISPEN得到的基于微卫星多态性的聚类图Fig.4.DendrogramwithDISPENsoftwarebasedonmi2crosatellitepolymorphismsBootstrap值是从100次重复抽样得到的Bootstrapvaluesarebasedon100resamplings1)利用4个微卫星标记IDVGA-11、IDV2GA-27、IDVGA-44、IDVGA-46分析了5个品种/群体牛的遗传结构。其PIC、H、Ne平均值分别为:南阳牛016569/016716/312764、延边牛015742/015982/218321、韩牛01531

28、7/015539/215144、西门塔尔牛016491/016792/313687、杂从品种特点来看:5个品种/群体中南阳牛为中国型瘤牛,而延边牛、韩牛及欧系的西门塔尔牛,属于普通牛,皮埃蒙特和南阳牛的杂种含有瘤牛和普通牛的血液,从NJ法聚类结果可见,南阳牛和杂种牛首先聚为一类,这是由于杂种牛含有1/2南阳牛血液,所以二者的遗传距离相近。在DISPAN软件中,NJ法将两节点分别以69%和79%的概率验证了PHYLIP软件中的NJ法。种牛016869/017098/315038。杂种牛变异最大,韩牛变异最小,南阳牛变异也较大。2)本文采用NJ法把5个品种/群体分为三类:延边牛和韩牛为一类,南阳牛和杂种牛为一类,西门塔尔牛自成一类,但西门塔尔牛与延边牛及韩牛的关系更近一些,都属于