拮抗TGFβ1可抑制胚胎干细胞来源BLCFC的产生和分化(1)

1、    拮抗TGF1可抑制胚胎干细胞来源BLCFC的产生和分化(1)    】 胚胎干细胞来源的BLCFC体外可分化产生造血和内皮细胞。为了研究TGF1对BLCFC产生和分化的调控作用，在拟胚体培养阶段施加TGF1和TGF1中和抗体，观察不同阶段TGF1对BLCFC的数目及其定向内皮和造血细胞分化能力的影响。结果表明：在拟胚体培养阶段拮抗TGF1的作用可显著降低BLCFC的数量(P<0.01)；与之吻合的，中和TGF1后拟胚体中Flk1 细胞比例降低。此外，在拟胚体培养阶段加入TGF1可显著增强BLCFC的造

2、血和内皮细胞分化能力，而中和TGF1后分化能力降低。结论： TGF1对BLCFC的产生和分化发挥正向调节作用。 【关键词】 TGF1；BLCFC；胚胎干细胞 Reduction of BlastColony Forming Cell Development and Bipotential Commitment by Neutralizing TGF1 In Vitro    Abstract    To study the regulation of TGF1 on the development of heman

3、gioblast, embryonic stem cellderived blast forming cells (BLCFC) were used as the model of hemangioblast in vitro. TGF1 or antiTGF1 neutralization antibody was added in the medium of embryoid body (EB) generation for observating influence of TGFB1 addition in different culture stages on nu

4、mber of BLCFC and differentiation of BLCFC to endothelial and hematopoietic cells. The results showed that antagonizing TGF1 in the course of EB growth could significantly reduce the number of BLCFC (P<0.01), and the frequency of Flk1 cells was also decreased consistently. Furthermore, the BLCFC

5、derived from EB pretreated with TGF1 demonstrated remarkably elevated hematopoietic and endothelial potential, whereas such bipotential was impaired in the group with neutralizing antibody. It is concluded that TGF1, a conventional negative regulator in hematopoiesis and angiogenesis exert positive

6、effects on the development and differentiation capacities of BLCFC in vitro.    Key words    TGF1； BLCFC； embryonic stem cells    胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESC) 来源的BLCFC (blastcolony forming cell) 的检测是研究成血血管细胞(hemangioblast)的主体外模型，已经为阐明某些

7、转录因子和细胞因子在成血血管细胞发育中的调控作用提供了有效的途径1,2。普遍的观点认为，TGF1是成体造血和内皮细胞增殖的抑制因子；TGF1/小鼠卵黄囊造血和内皮系统的发育异常也表明其在胚胎早期发育中对于中胚层细胞分化、卵黄囊血管发生极为重。此外，TGF1可体外诱导鸟类体壁中胚层细胞分化的同时产生造血和内皮细胞，提示其在成血血管细胞发育中具有重作用。最近的研究证明，TGF1信号通路下游分子Smad5基因敲除的ESC中BLCFC数量明显高于野生型3。因此，TGF1对成血血管细胞发育的调控值得深入研究。    材料和方法   &

8、#160;细胞因子及抗体    重组人血小板生成素(rhTPO)、小鼠碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、小鼠血管内皮生长因子(VEGF)、小鼠干细胞因子(SCF)、小鼠白介素3 (IL3)、 重组人白介素11 (rhIL11)、 小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)）、小鼠胰岛素样生长因子(IGF1)均为PeproTech公司产品。小鼠白血病抑制因子(mLIF)为Chemicon公司产品。重组人促红细胞生成素(rhEpo)为日本麒麟啤酒株式会社产品。TGF1和AntiTGF1中和抗体中国实验血液学杂志 J Exp Hematol 2007; 1

9、5(2)拮抗TGF1可抑制胚胎干细胞来源BLCFC的产生和分化购自R&D 公司。大鼠抗小鼠血管内皮钙黏蛋白(VECadherin)单克隆抗体、大鼠抗小鼠CD31单克隆抗体均为PharMingen公司产品。FITC标记的羊抗大鼠二抗为Santa Cruz公司产品。    ESC培养    DMEM、IMDM、胎牛血清、L谷氨酰胺、非必需氨基酸、胰蛋白酶均为Hyclone公司产品。硫代甘油(MTG)为Sigma公司产品。无蛋白杂交瘤培养基II (PFHM II) 购自GibcoBRL公司。  

10、;  小鼠ESC系（CCE）4,5由StemCell Technologies公司惠赠。应用Co60照射后的小鼠胚胎成纤维细胞作为滋养层进行ESC的维持培养6。维持培养体系组成为： DMEM、15%胎牛血清、2 mmol/L L谷氨酰胺、0.1 mmol/L非必需氨基酸、100 mol/L 硫代甘油及mLIF 1 000 U/ml。    ESC分化形成拟胚体    用0.25%的胰蛋白酶消化CCE获得单细胞悬液后以2.5×104个细胞/60 mm细菌培养皿(Greiner公司)的密度

11、种入拟胚体(embryonic body, EB)培养体系。体系组成： IMDM、 15%胎牛血清、0.9%甲基纤维素、450 mol/L MTG、5% PFHM II、2 mmol/L L谷氨酰胺。不同的实验组分别加入TGF1(2 ng/ml)和AntiTGF1中和抗体。培养条件为37、5% CO2，饱和湿度。    BLCFC培养    收集培养第3天的EB，经0.25%的胰蛋白酶消化成单细胞悬液，以5×104/ml的细胞密度种入35 mm细菌培养皿中(Greiner)。CFUBL(blastcolo

12、ny forming unit)集落培养体系为： IMDM、10%胎牛血清、0.9%甲基纤维素、450 mol/L MTG、25 g/ml抗坏血酸(Sigma)、200 g/ml转铁蛋白(Sigma)、2 mmol/L L谷氨酰胺、5 ng/ml VEGF、50 ng/ml SCF、20 ng/ml TPO。培养67天后观察和鉴定BLCFC形成的CFUBL集落。显微镜下挑取单个集落种入液体扩增体系。此体系组成为： IMDM、10%胎牛血清、10%马血清(Hyclone)、2 mmol/L L谷氨酰胺、450 mol/L MTG、50 ng/ml SCF、10 ng/ml IL3、10 ng/m

13、l IL11、5 ng/ml VEGF、6 U/ml EPO、10 ng/ml bFGF、10 ng/ml IGF1。培养条件同上。    流式细胞术检测    同上方法收取培养第3天EB细胞，用100 l PBS重悬细胞，加入2 l大鼠抗小鼠Flk1抗体(eBioscience产品)，室温避光反应30分钟，用PBS清洗2次，每次300×g离心10分钟，加入2 l PE标记的羊抗大鼠二抗(Southern Biotechnology Associates, Inc产品)，室温避光反应30分钟，PBS清洗2

14、次后用流式细胞仪检测。            作者：晖宇 刘兵 王晓燕 毛宁【摘】胚胎干细胞来源的BLCFC体外可分化产生造血和内皮细胞。为了研究TGF         本篇论文是由3COME文档频道的网友为您在网络上收集整理饼投稿至本站的，论文版权属原作者，请不用于商业用途或者抄袭，仅供参考学习之用，否者后果自负，如果此文侵犯您的合法权益，请联系我们。   

15、0;造血祖细胞集落培养    收集单个CFUBL集落来源的非贴壁细胞种入造血祖细胞集落培养体系，IMDM含15%胎牛血清、0.9%甲基纤维素、450 mol/L MTG、200 g/ml转铁蛋白、2 mmol/L L谷氨酰胺、50 ng/ml SCF、10 ng/ml IL3、10 ng/ml IL11、20 ng/ml TPO、6 U/ml EPO。培养条件同上。    免疫荧光染色    上述液体扩增体系中去除非贴壁细胞后，贴壁细胞继续在含有5 ng/ml VEGF、10

16、 ng/ml bFGF、10 ng/ml IGF1的培养液中培养12周。对贴壁细胞进行VECadherin和CD31免疫荧光标记，操作按公司提供的说明书进行。    DiIAcLDL吞噬实验    在上述含有贴壁细胞的培养基中加入10 g/ml DiIAcLDL (Biomedical Technologies产品)，37 孵育4小时后用PBS清洗数次，置荧光显微镜下观察。    实验分组    实验分为5组，具体见附表。 &

17、#160;  统计学分析    Student t检验，P值小于0.05具有统计学意义。        结    果    EB培养阶段拮抗TGF1可抑制BLCFC的产生    ESC在半固体培养基中自发分化形成具有三胚层细胞的EB，EB中的BLCFC在VEGF和SCF存在的培养体系中产生典型形态的“CFUBL”集落。 

18、0;  检测结果表明：在EB培养中加入TGF1的TEB组与正常组相比BLCFC均数略高， t检验P=0.7109，无统计学差异；加入Anti TGF1 抗体的AbEB组的BLCFC数目较正常组显著降低(P=0.0058，图1)。    Figure 1. Influence of TGF1 and anti TGF1 antibody on the number and colony formation of BLCFC. *P<0.01， compared with control.   

19、0;TGF1抑制CFUBL集落生长    如图1所示，在CFUBL集落培养体系中加入TGF1可明显抑制CFUBL集落的生长 (P=0.0014)，而加入Anti TGF1并不改变BLCFC的数目。    TGF1可增加EB中Flk1 细胞的比例    分别收集正常组、TEB组和AbEB组培养第3天EB细胞，流式细胞术检测Flk1 细胞比例，TEB组Flk1 细胞比例有所升高，而AbEB组则为降低(图2)。    Figure 2. In

20、fluence of TGF1 and anti TGF1 antibody on the frequency of Flk1 positive cells.    EB形成过程中TGF1可增强BLCFC的造血和内皮分化能力    按照已建立的BLCFC造血和内皮分化能力的鉴定方法6，各组CFUBL集落细胞进行造血细胞集落培养，并统计CFU的数量。TEB组中单个CFUBL集落产生的造血细胞集落数量显著高于正常组，而AbEB组CFU数量明显降低（图3）。为研究TGF1对 BLCFC内皮细胞分化能力的影响，我们统计了各

21、组可产生内皮细胞的CFUBL集落的比例。结果表明，AbEB组的比例较正常组有明显的下降（图4）。    讨    论    TGF1作为造血负调控因子，主是通过抑制处于静止期的早期造血干祖细胞进入分裂期，从而选择性和可逆性地抑制造血组织中早期细胞的增殖。然而，TGF1在整个造血调控中的作用却极为复杂，不同时期不同发育阶段的细胞群体对TGF1的反应性不尽相同。在体外TGF1明显抑制骨髓中早期造血祖细胞如HPPCFC的数量，但并不影响晚期造血细胞集落的数目。TGF1/小鼠并没有出

22、现造血细胞的增多，反而使红细胞减少，同时出现内皮细胞分化异常。TGF1及其受体缺陷的小鼠无一例外都同时影响到造血和血管内皮系统的发育，提示TGF1在成血血管细胞发育阶段具有重作用。    在EB培养阶段加入TGF1并不影响BLCFC的数量，但加入TGF1中和抗体则使BLCFC的数量明显下降，显示出血清中或EB细胞自身分泌的内源性TGF1可促进EB细胞分化产生BLCFC。这与文献报道7TGF1可体外诱导体壁中胚层细胞分化同时产生造血和内皮细胞的结果相符。研究表明，Flk1可作为成血血管细胞表面标志1，因此为了验证TGF1对EB细胞产生BLCFC的促进作用，

23、同时观察了TGF1对EB细胞产生Flk1细胞的作用，得到了与BLCFC相一致的结果： TGF1可促进EB细胞分化产生Flk1细胞，TGF1中和抗体则相反。    此外，TGF1的中和抗体在EB培养阶段不但减少BLCFC的数量，同时可影响BLCFC的分化能力。单个CFUBL集落获得的造血细胞中CFU的含量在TEB组中较正常组高，AbEB组则相反。CFU的增加说明了TGF1对BLCFC造血细胞分化能力的促进。同样，AbEB组CFUBL集落中具有内皮细胞分化能力的集落所占的比例明显低于正常组，说明AbEB组BLCFC内皮细胞分化能力的降低。以上各组的差别在于E

24、B培养阶段是否加入TGF1或TGF1的中和抗体，而在CFUBL集落培养阶段培养体系与正常组完全相同，这就提示TGF1在促进EB细胞分化产生BLCFC的同时也在一定程度上提高了其向造血和内皮细胞分化的能力。TGF1基因敲除小鼠胚胎表现为内皮细胞的分化异常和卵黄囊中红细胞的减少，但无法确定内皮细胞的分化异常是在其终末分化时因TGF1的缺失而发生异常，还是在内皮细胞从中胚层分化产生之初因TGF1的缺失而其后的分化受到影响。TGF1对BLCFC造血和内皮细胞分化的能力的影响的结果提示，TGF1对中胚层细胞诱导分化产生成血血管细胞的同时就决定了其向造血和内皮细胞分化的能力。  

25、60; 外源性加入的TGF1在Blast集落培养阶段几乎完全抑制CFUBL集落的生长。最近的研究也证明，TGF1可抑制VEGF介导的内皮细胞和造血细胞的扩增8，提示TGF1对CFUBL集落生长的抑制可能是其抑制内皮和造血细胞扩增的结果。    值得注意的是， TGF1在BLCFC产生前后调控作用的不同，在EB分化产生BLCFC过程中表现为促进作用，而在BLCFC形成CFUBL集落过程中则为抑制。此现象提示TGF1对成血血管细胞发育的调控在其产生前后有着严密而精细的调节方式和机理。因此，阐明TGF1在成血血管细胞发育中的调控作用及其机理是非常有趣

26、而复杂的课题。【参考文献】1Faloon P, Arentson E, Kazarov A, et al. Basic fibroblast growth factor positively regulates hematopoietic development. Development, 2000; 127:1931-1941            作者：晖宇 刘兵 王晓燕 毛宁【摘】胚胎干细胞来源的BLCFC体外可分化产生造血和内皮细胞。为了研究TGF 

27、0;       本篇论文是由3COME文档频道的网友为您在网络上收集整理饼投稿至本站的，论文版权属原作者，请不用于商业用途或者抄袭，仅供参考学习之用，否者后果自负，如果此文侵犯您的合法权益，请联系我们。2Ema M, Faloon P, Zhang WJ, et al. Combinatorial effects of Flk1 and Tal1 on vascular and hematopoietic development in the mouse. Genes Dev, 2003; 17:380-3933Liu B, Sun