新生SD大鼠坐骨神经Wallerian变性规律及其S-100蛋白表达和雪旺细胞增殖研究

1、新生SD大鼠坐骨神经Wallerian变性规律及其S-100蛋白表达和雪旺细胞增殖研究    【摘要】  目的:了解新生SD大鼠周围神经Wallerian变性不同时间点S-100蛋白表达变化及对雪旺细胞增殖的影响。方法:10 d龄SD大鼠坐骨神经进行结扎预变性，分别于术后24 h、3 d、5 d、7 d和9 d，进行雪旺细胞培养和S-100免疫组织化学染色观察。结果:在损伤周围神经的近端发生可逆性变性，远端则发生永久性Wallerian变性。实验组雪旺细胞增殖速率与S-100蛋白阳性染色率均优于对照组，7 d组增殖能力达到高峰，S-100蛋白阳

2、性染色率约51%56%，与对照组比较差异有显著性。结论:新生SD大鼠周围神经受损后变性过程类似于经典的 Wallerian变性，且能在变性中期获得活力较强及倍增时间较短的雪旺细胞。 【关键词】  雪旺细胞 Wallerian变性 人工神经 组织工程     Abstract:  Objective: To study the S-100 expression change and the effect of reproductive activity on Schwann cells at different time points durin

3、g Wallerian degeneration of the peripheral nerve of the neonatal SD rats. Methods: The sciatic nerves of the 10-day rats were ligated and pre-degenerated and the experimental result was analyzed with the methods of Schwann cells culture and S-100 protein was post-operatively observed in 24 hours, th

4、e 3th day, 5th day, 7th day and 9th day, respectively. Results: The reversible degeneration could take place at the proximal extremity of the damaged peripheral nerve, but the permanent Wallerian degeneration took place at the distal extremity. The reproductive rate of Schwann cells and the positive

5、 staining rate in the experimental group were better than that of the control group. The reproductive ability in the 7th day group reached the peak and the positive rate of S-100 protein was about 51%56% in the 7th day. It had significant difference when compared to the control group. Conclusion: Th

6、e degenerative process of damaged peripheral nerve of the neonatal SD rats is similar to the process of the typical Wallerian degeneration. The stronger reproductive activity and the shorter doubling time of Schwann cells can be obtained during the middle stage of Wallerian degeneration.   

7、;  Key words:  Schwann cell; Wallerian degeneration; artificial nerve; tissue engineering     周围神经受到卡压、断裂等损伤后，在损伤远端将不可避免发生Wallerian变性，雪旺细胞呈阶段性增殖，为神经轴突再生修复提供神经营养因子。笔者利用这一现象对成年大鼠周围神经作预变性，在其增殖期内取材培养以获取激活态雪旺细胞1；另有研究表明，新生动物来源性雪旺细胞比成年动物增殖活性高。     本实验对新生10 d龄SD大鼠坐骨神经

8、进行结扎预变性，参照成年大鼠经典Wallerian变性规律，在变性后不同时间点取材，进行雪旺细胞培养及坐骨神经S-100蛋白免疫组织化学染色观察，并与未预变性组对比，观察并分析新生SD大鼠Wallerian变性的规律。     1  材料和方法     1.1  材料与试剂     1.1.1  实验动物：10 d龄SD大鼠，雌雄不限，体重2530 g（东南大学医学院实验动物中心提供）。     1.1.2  实验用主要试剂与仪器：CO

9、2培养箱（Heraeus BB5060uv型），倒置显微镜（Nikon TS100型），高速台式离心机（TDL-16G），型胶原酶（Gibaco），DMEM/F12培养液（Gibaco），胎牛血清（杭州四季青公司生产），50 ml培养瓶（丹麦NUNC公司生产）、胰蛋白酶（Sigma公司生产），多聚赖氨酸（Sigma生产），S-100免疫组化试剂盒（北京中山公司提供）。     1.2方法     1.2.1  实验动物选取及分组：随机选取10 d龄SD大鼠80只，所有新生大鼠右侧坐骨神经预Wallerian变性作为实验组，左

10、侧不予处理作为自身对照组。由8只母鼠喂养。分别于术后24 h、3 d、5 d、7 d和9 d随机选取16只进行实验，其中8只进行雪旺细胞培养，余下作免疫组织化学染色观察。     1.2.2新生SD大鼠坐骨神经Wallerian变性：所有新生SD大鼠术前均禁饮8 h，经0.2%戊巴比妥钠（30 mg/kg）腹腔麻醉后，在无菌条件下作右股后正中切口显露股二头肌和臀后血管束，游离右侧坐骨神经，在梨状肌下缘3 mm处用5-0丝线结扎坐骨神经，留2 mm线头标记，分层缝合切口；左侧坐骨神经不予处理。术后仍由母鼠喂养。术后未有新生鼠死亡，排除对照组切口感染1只，余79只纳入

11、检测、统计。     1.2.3  雪旺细胞培养：随机选取术后24 h组、3 d组、5 d组、7 d组和9 d组新生SD大鼠各8只，经引颈处死后，浸入0.3%碘伏5 min，切取40只鼠右侧结扎线远侧端1.2 cm长的坐骨神经和左侧同等长度坐骨神经，并将实验组与对照组所有坐骨神经集中培养。按双酶消化培养法获得原代雪旺细胞，将雪旺细胞稀释成（2.53.0）×105/ml，接种1.5 ml于50 ml培养瓶，置于37 、含5% CO2温箱培养24 h后，用含10-5mol/L的Ara-C的DMEM/F12混合培养液作用24 h，后改为正常DMEM/

12、F12血清培养液培养。5 d后，待细胞长满培养瓶时，用0.25%胰蛋白酶消化传代，每周更换培养液2次。     1.2.4  绘制雪旺细胞的生长曲线：当24 h组、3 d组、5 d组、7 d组和9 d组及对照组传2代后的雪旺细胞长满培养瓶底时，在每天同一时间点，吸出培养基，勿弃之，用PBS溶液冲洗2次，勿剧烈震荡。然后加入0.25%胰蛋白酶消化并于显微镜下观察，待贴壁的细胞收缩、变圆后，但尚未脱落时移去消化液，把原培养液倒回，用毛细吸管充分反复吹打制成细胞悬液，镜下观察，所有细胞从培养板壁脱落，取细胞悬液于细胞计数板上计算每ml的细胞数，绘制雪旺细胞生长

13、曲线,并统计术后不同时间点的所有观察天数雪旺细胞总数。     1.2.5  S-100免疫组化染色观察：与取材作雪旺细胞培养的同时，各组动物经引颈处死后，将术后24 h组、3 d组、5 d组、7 d组和9 d组余下的新生SD大鼠实验侧及对照侧坐骨神经同时取出，置入10%甲醛溶液中，经过常规石蜡切片过程，制成结扎线远侧1 cm坐骨神经的纵切片和横切片，然后采用北京中山公司提供的美国ZYMED公司生产的SP-9003试剂盒对组织切片进行免疫组织化学染色。用同济医科大学HPIAS-1000 病理图像分析系统在400倍镜下每例取3个视野进行自动盲测，计数每视野

14、阳性雪旺细胞数。     1.3  统计学处理方法  所有试验结果均重复3次以上，计量资料以±s表示，所有的数据用统计软件SPSS13.0进行统计学分析，不同时间点的实验组与对照组之间采用t检验，实验组的不同时间组间采用单因素方差分析。     2  结果     2.1  雪旺细胞观察  经双酶消化法培养及Ara-C作用去除成纤维细胞，并传代2次后，在倒置显微镜下对术后24 h组、3 d组、5 d组、7 d组和9 d组及对照组进行雪旺细胞观察。

15、结果发现各实验组均比对照组雪旺细胞生长旺盛，增殖速率快于对照组，且细胞倍增时间短于对照组，尤以7 d组最明显(见图1，图2)。雪旺细胞呈长梭形，胞体狭窄，胞核透光，核周边缘有一明亮光晕，并伸出约45m的细长突起，状如麦芒，为单极和双极，少见三极，突起长度可达胞体横径510倍，继续培养后，雪旺细胞的突起继续增长，并按略呈“圆形”的规则形状不断生长、分裂和繁殖，细胞突起首尾相互融合、交联，瓶壁上有少许生长不佳的成纤维细胞。每视野雪旺细胞的阳性率约为95%。x    【摘要】  目的:了解新生SD大鼠周围神经Wallerian变性不同时间点S-100

16、蛋白表达变化及对雪旺细胞增殖的影响。方法:10 d龄SD大鼠坐骨神经进行结扎预变性，分别于术后24 h、3 d、5 d、7 d和9 d，进行雪旺细胞培养和S-100免疫组织化学染色观察。结果:在损伤周围神经的近端发生可逆性变性，远端则发生永久性Wallerian变性。实验组雪旺细胞增殖速率与S-100蛋白阳性染色率均优于对照组，7 d组增殖能力达到高峰，S-100蛋白阳性染色率约51%56%，与对照组比较差异有显著性。结论:新生SD大鼠周围神经受损后变性过程类似于经典的 Wallerian变性，且能在变性中期获得活力较强及倍增时间较短的雪旺细胞。 【关键词】  雪旺细胞 Waller

17、ian变性 人工神经 组织工程     Research on the rule of the Wallerian degeneration of the sciatic nerve in the neonatal SD rats, its S-100 protein expression and the proliferation of Schwann cells  CHU Ting-gang*, GAO Wei-yang, HUANG Jing-long, et al. *Department of Orthopaedics, the Second

18、Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College, Wenzhou, 325027     Abstract:  Objective: To study the S-100 expression change and the effect of reproductive activity on Schwann cells at different time points during Wallerian degeneration of the peripheral nerve of the neonatal S

19、D rats. Methods: The sciatic nerves of the 10-day rats were ligated and pre-degenerated and the experimental result was analyzed with the methods of Schwann cells culture and S-100 protein was post-operatively observed in 24 hours, the 3th day, 5th day, 7th day and 9th day, respectively. Results: Th

20、e reversible degeneration could take place at the proximal extremity of the damaged peripheral nerve, but the permanent Wallerian degeneration took place at the distal extremity. The reproductive rate of Schwann cells and the positive staining rate in the experimental group were better than that of

21、the control group. The reproductive ability in the 7th day group reached the peak and the positive rate of S-100 protein was about 51%56% in the 7th day. It had significant difference when compared to the control group. Conclusion: The degenerative process of damaged peripheral nerve of the neonatal

22、 SD rats is similar to the process of the typical Wallerian degeneration. The stronger reproductive activity and the shorter doubling time of Schwann cells can be obtained during the middle stage of Wallerian degeneration.     Key words:  Schwann cell; Wallerian degeneration; art

23、ificial nerve; tissue engineering     周围神经受到卡压、断裂等损伤后，在损伤远端将不可避免发生Wallerian变性，雪旺细胞呈阶段性增殖，为神经轴突再生修复提供神经营养因子。笔者利用这一现象对成年大鼠周围神经作预变性，在其增殖期内取材培养以获取激活态雪旺细胞1；另有研究表明，新生动物来源性雪旺细胞比成年动物增殖活性高。     本实验对新生10 d龄SD大鼠坐骨神经进行结扎预变性，参照成年大鼠经典Wallerian变性规律，在变性后不同时间点取材，进行雪旺细胞培养及坐骨神经S-100蛋白免疫组织

24、化学染色观察，并与未预变性组对比，观察并分析新生SD大鼠Wallerian变性的规律。     1  材料和方法     1.1  材料与试剂     1.1.1  实验动物：10 d龄SD大鼠，雌雄不限，体重2530 g（东南大学医学院实验动物中心提供）。     1.1.2  实验用主要试剂与仪器：CO2培养箱（Heraeus BB5060uv型），倒置显微镜（Nikon TS100型），高速台式离心机（TDL-16G），型胶原酶（

25、Gibaco），DMEM/F12培养液（Gibaco），胎牛血清（杭州四季青公司生产），50 ml培养瓶（丹麦NUNC公司生产）、胰蛋白酶（Sigma公司生产），多聚赖氨酸（Sigma生产），S-100免疫组化试剂盒（北京中山公司提供）。     1.2方法     1.2.1  实验动物选取及分组：随机选取10 d龄SD大鼠80只，所有新生大鼠右侧坐骨神经预Wallerian变性作为实验组，左侧不予处理作为自身对照组。由8只母鼠喂养。分别于术后24 h、3 d、5 d、7 d和9 d随机选取16只进行实验，其中8只进行雪旺细胞培养，余下作免疫组织化学染色观察。     1.2.2新生SD大鼠坐骨神经Wallerian变性：所有新生SD大鼠术前均禁饮8