携带人白细胞介素10和肝细胞生长因子双基因的重组腺病毒载体构建与鉴定

1、携带人白细胞介素10和肝细胞生长因子双基因的重组腺病毒载体构建与鉴定         11-03-23 15:53:00     编辑：studa20                  作者：邱红, 朱月蓉, 邢继成, 江淑芳 苏长青, 曹祥荣 方琳 【摘要】  目的： 构建携带

2、人白细胞介素10(hIL10)和人肝细胞生长因子(hHGF)双基因的重组腺病毒载体。方法： 分别以pDC316hIL10EGFP和pCDNA3hHGF重组质粒为模板，PCR扩增获得hIL10和hHGF基因片段，与pIRES连接成为hIL10IREShHGF，测序正确后酶切，与pDC315连接，获得穿梭质粒pDC315hIL10IREShHGF，与腺病毒包装系统转染293细胞，包装产生重组腺病毒hIL10hHGF，PCR鉴定后，扩增病毒，并测定病毒滴度。用重组腺病毒转染BEL7402和WRL68细胞，ELISA法检测上清液中hIL10和hHGF的含量。结果： 成功构建了重组腺病毒hIL10hHG

3、F，扩增纯化后测得重组腺病毒滴度为1×109 pfu/ml,转染BEL7402和WRL68细胞72 h后，表达hIL10的量分别为(6 271.7±5.2) pg/ml和(350.6±12.4) pg/ml,表达hHGF的量分别为(20 827.1±345.5) pg/ml和(201.6±10.1) pg/ml。结论： 本实验为进一步研究AdhIL10hHGF在动物体内抗肝炎、肝纤维化作用奠定了基础。 【关键词】  白细胞介素10; 肝细胞生长因子; 腺病毒载体Abstract Objective: To construct the

4、recombinant adenovirus vector carrying human interlerkin10(hIL10) and human hepatocyte growth factor(hHGF).Methods： We amplified hIL10 and hHGF genes by PCR with plasmids pDC316hIL10EGFP and pCDNA3hHGF, respectively, and subcloned into pIRES to generate hIL10IREShHGF. Confirmed by sequence analysis,

5、 the hIL10IREShHGF genes were inserted into the vector pDC315, then the shuttle plasmid pDC315hIL10IREShHGF was constructed, which was cotransfected with the adenovirus skeleton plasmid into 293 cells to obtain the recombinant adenovirus vector hIL10hHGF. After identified the target genes by PCR, th

6、e recombinant adenovirus was propagated and the viral titer was determined. hIL10 and hHGF proteins in the virusinfected BEL7402 and WRL68 cells were measured by ELISA. Results： We obtained recombinant adenovirus vector of hIL10hHGF successfully. After propagation, the titer of the recombinant adeno

7、virus was 1×109 pfu/ml. The recombinant adenovirus could express hIL10 and hHGF in BEL7402 and WRL68 cells effectively. The concentrations of hIL10 were(6 271.7±5.2) pg/ml and(350.6±12.4) pg/ml respectively, and the concentrations of hHGF were(20 827.1±345.5) pg/ml and(201.6±

8、;10.1) pg/ml respectively. Conclusion： The recombinant adenovirus vector hIL10hHGF seted the foundation for the gene therapy of hepatitis and cirrhosis in animals.Key words interlukin10; heptocyte growth factor; adenovirus vector 肝炎、肝炎后肝硬化严重危害人类健康，通过基因治疗手段来预防和减轻肝损伤是近年来人们研究的一个新方向。IL10是一个多效性细胞因子, 具有广泛

9、的生物学作用。研究表明内源性IL10 对肝细胞具有保护作用，而且给予外源性IL10 也显示了明显的抗肝细胞损伤作用1,2。肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)被认为是最强的肝再生促进剂，是一种具有多功能的生物大分子，它有强效的抗肝炎、促肝再生作用3,4。本研究拟构建人IL10和HGF双表达的重组腺病毒hIL10-HGF，为腺病毒介导IL10及HGF基因治疗肝炎、预防肝损伤建立实验基础。1 材料与方法1.1 材 料1.1.1 质粒和菌株 含HGF基因的质粒pCDNA3HGF由江苏省人民医院血液科惠赠，含hIL10基因的质粒pDC316EGFPhIL10,p

10、IRES,pDC315,pDC312,大肠埃希菌菌株Top10、腺病毒骨架质粒、腺病毒包装细胞HEK293细胞和肝癌BEL7402、正常肝脏WRL68细胞均由南京师范大学生命科学学院细胞生物学实验室惠赠。1.1.2 酶类和主要试剂 限制性内切酶、T4连接酶、Taq DNA聚合酶、Pyrobest DNA,DNA 标准参照物、蛋白酶K购自Takara公司;DMEM购自Gibco BRL公司;DMSO为Amresco公司产品;胎牛血清购自杭州四季清公司，56灭活30 min;转染试剂Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司;0.22 m无菌滤器及滤膜购自Millipore公

11、司;胶回收纯化试剂盒及质粒提取试剂盒购自AXYGEN公司，引物由上海生工公司合成。1.2 方 法1.2.1 PCR法扩增目的基因 以pDC316hIL10EGFP和pCDNA3hHGF为模板，hIL10上下游引物5端分别引入NheI和EcoRI的位点，上游引物P1：5CGGCTAGCACCATGCACAGCTCAGCACTGC3;下游引物P2：5GAGAATTCTCAGTTTCGTATCTTC3;HGF上下游引物5端分别引入Xba和Sal酶切位点，P3：5GCTCTAGAACCATGTGGGTGACCAAACTC3;下游引物P4：5GAGTCGACCTATGACTGTGGTAC 3; 94预变

12、性5 min，然后94变性30 s，58退火30 s，72延伸1 min，30个循环，72连续延伸7 min。扩增完毕后进行胶回收获得目的片段。1.2.2 测序质粒的构建与鉴定 Nhe,EcoR和Xba,Sal分别酶切pIRES及目的片段，割胶回收纯化，用T4 DNA连接酶与hIL10,hHGF连接，片段载体=31(摩尔比)。将连接产物转化Top10感受态，涂布于含50 mg/L氨苄西林的LB琼脂平板，37,220 r/min恒温摇床振摇16 h。抽提质粒，30 l ddH2O溶解。取10 l抽提质粒和载体pDC312分别用Nhe,Sal酶切，产物电泳，割胶回收hIL10IREShHGF片段和

13、线性化载体pDC312，T4 DNA连接酶连接，转化，抽提质粒，酶切鉴定。取鉴定阳性的质粒12 l送上海生工公司测序，测序正确的质粒命名为pDC312hIL10IREShHGF。1.2.3 重组穿梭质粒的构建与鉴定 Nhe、Sal酶切pDC312hIL10IREShHGF，0.8%琼脂糖凝胶电泳，回收产物，30 l ddH2O溶解，T4 DNA连接酶连接，转化Top10感受态，与含50 mg/L氨苄西林的LB琼脂平板筛选，挑取20个最小克隆接种至2 ml LBAmp+(50 g/ml)液体培养基，37，220 r/min恒温摇床振摇过夜，取菌液进行菌液电泳，选出可疑阳性的菌株进行PCR鉴定，确

14、定含2 200 bp和540 bp条带后，选两个阳性菌株进行大量扩增，采用碱裂解法抽提质粒，获得pDC315hIL10IREShHGF。1.2.4 腺病毒的包装、鉴定及扩增 2 g质粒和2 g腺病毒骨架质粒共转染HEK293细胞，37 5%CO2培养57 d，细胞病变，-80、37水浴冻融5次收集病毒，再次感染HEK293细胞，最终收集的PBS重悬病毒上清，PCR鉴定，分别以含目的基因的重组穿梭质粒、重组腺病毒及不含目的基因的重组腺病毒为模板进行扩增，反应条件同“1.2.1”，鉴定后-80分装保存。重组腺病毒命名为AdhIL10hHGF。1.2.5 TCID50法滴定重组腺病毒效价 10%的培养液调整HEK293细胞为1×105个/ml，接种至96孔板，100 l/孔，培养24 h;分别加入10-110-12浓度的病毒，留最后两孔加入无血清培养基作为对照孔，