应用套式PCR方法检测猪圆环病毒2型_图文

1、应用套式PCR方法检测猪圆环病毒2型赵浩军1,范伟兴23,姜平1,李晓成2,黄保续2(1.南京农业大学动物医学院,江苏南京210095;2.农业部动物检疫所,山东青岛266032摘要:根据Genbank中发表的猪圆环病毒2型(PCV2全基因序列,设计2对PCV2特异性引物,建立套式PCR检测方法。外测引物p1、p2扩增片段长度为647bp(922738,内测引物p3、p4扩增长度为219bp(3192537。其中用外部引物可扩增DNA含量到10-5mg/mL,而套式PCR 则比普通PCR灵敏性还要提高103倍。用该方法对山东、安徽和河北10省的899份临床发病猪的肺脏和淋巴结样品进行检测,结果

2、有329份样品检测出阳性,平均阳性检测率达3616%。由此可见,PCV2感染在全国范围内的发病猪群中普遍存在。关键词:猪圆环病毒2型;套式PCR;检测中图分类号:S858128文献标识码:B文章编号:052925130(20061220040203猪圆环病毒(Porcine circovirus,PC V是由Tischer于1974年发现的一种病毒,为无囊膜的单股负链DNA病毒,病毒粒子直径约1720n m,二十面体对称,是迄今已知最小的动物病毒之一1。PC V属圆环病毒科(C ircoviridae圆环病毒属(C ircovirus成员。根据PCV抗原性及基因组不同,分为2种基因型或血清型,

3、即PC V1和PCV2。PCV1基因组全长1759bp,是由Tiseher等于1974年首次从猪传代细胞系PK215中作为一种污染物分离出来的病毒,动物实验表明该病毒无致病性,广泛存在于正常猪体内各组织器官2-4。PCV2基因组全长1767bp或1768bp,与近年来发生的断奶仔猪多系统衰竭综合征(post w eaning multisyste m ic wasting syndr ome,P MW S收稿日期:2006202227基金项目:国家动物流行病学中心专项基金及浙江省科技攻关项目资助。作者简介:赵浩军(19792,男,硕士研究生。3通讯作者。密切相关5-7,该病毒主要侵害512周龄

4、断奶仔猪,主要临床症状为渐进性消瘦、呼吸困难急促、贫血、腹泻、黄疸、间质性肺炎、淋巴腺炎及肾炎。猪圆环病毒病已成为全球性流行,该病的发生和蔓延已经给世界养猪业造成巨大的经济损失。同时有资料表明PCV常与猪呼吸与繁殖综合征病毒(PRRS V、猪细小病毒(PP V、猪伪狂犬病毒(PRV等混合感染猪8。因此,建立PCV2的检测方法,进行PC V2的监测调查,有助于我们掌握国内PCV2疫情,为进一步制定PCV2感染的防控政策和措施提供理论依据。1材料与方法111细胞、毒株与病料PK215细胞为本实验室保存,PCV2毒株9(AY556473、PCV1、PRRS V、PRV和PP V为本实验室分离鉴定并保

5、存;病料分别来自山东、福建、浙江、甘肃、湖南、辽宁、黑龙江、湖北、河南和河北等10省899份临床发病猪的肺脏和淋巴结。的效果理想,其回收量和纯度足以进行各种分子生物学及其他方面的研究。参考文献:1L illehoj H S.Role of ly mphocytes and cyt okines in coccidi osisJ.I nt J Parasit ol,1998,28:107121081.2St otish R L,W ang C C.Preparati on and purificati on of mer oz oites ofEi m eria tenellaJ.J Paras

6、it ol,1975,61(1:7002703.3St otish R L.Separati on of s por ozoites,s por ocysts and oocysts of Ei m2eria tenella by centrifugal elutriati onJ.J Parasit ol,1977,63(6:112421126.4Bontemp sM,Yvore P.Technique de purificati on des sus pensi ons des por oz oites dEi m eria sur col onne des fibres syntheti

7、quesJ.AnnRech Vet,1974,(5:1092113.5W agebach G E.Purificati on of Ei m eria tenella s por oz oites with glassbead columnJ.J Parasit ol,1969,55:8332838.6Schmatz D M.Purificati on of E i m eria tenella s por oz oites by DE252ani on exchange chr omat ographyJ.J Pr ot ozool,1984,31(1:1812183.7田广孚,田增义.柔嫩

8、艾美耳球虫子孢子的提纯J.中国兽医杂志.1989,15(4:27228.8蒋建林,蒋金书.柔嫩艾美耳球虫各阶段虫体分离纯化方法的改进J.中国农业大学学报,1996,1(5:992106.9安健,汪明,韩春来,等.柔嫩艾美耳球虫裂殖子的分离纯化J.中国兽医科技,2003,33(12:54257.10Ouarzane M,LabbeM,Pery P.Purificati on of Ei m eria tenella firstgenerati on schizontsJ.J Parasit ol,1998,84(5,102721031. 11Xie M Q,GillbertA L,FullerA

9、 L,et al.A ne w method for purifica2ti on of Ei m eria tenella mer oz oitesJ.Parasit ol ogy,1990,76:5662 569.12Fernando M A,A lattarM A,Boules G H.Preparati on of second gen2erati on mer oz oites of E i m eria necatrix fr om host tissueJ.J Parasi2t ol ogy,1984,70:1542155.4Ani m al Husbandry&Vete

10、rinary Medicine2006Vol138No112112主要试剂DNAZol Reagent 试剂盒购自I nvitr ogen 公司,D 2氨基葡萄糖购自Sig ma 公司,Taq DNA 聚合酶(5U /L 、Mg 2+(25mmol/L 、d NTP (25mmol/L 、PCR 回收纯化试剂盒、DL 22000Marker 均购自TakaRa 公司。113引物设计根据Gen Bank 中发表的PCV2(AY556473全基因序列,设计以下2套引物。其中一扩引物p1、p2扩增片段长度为647bp (922738,二扩引物p3、p4扩增长度为219bp (3192537。引物由上

11、海生物技术有限公司合成,用高压灭菌超蒸水溶解配成100pmol/L,-20保存,用时稀释成20pmol/L 。一扩引物 p1:52GGTT ACACGG AT ATTGT AGT CC 23p2:52CGTT ACCGCAG AAG AAG AC AC 23二扩引物p3:52TGGGT CAT AGGTT AGGGC ATTG 23p4:52GCGGTGG AC ATG ATG AG ATTT A 23114病毒的增殖按常规方法培养无PCV1污染的PK 215细胞,用毒株(AY556473接种细胞,37孵育12h,加入含有2%小牛血清的DME M 维持液,置375%CO 2细胞培养箱中培养,2

12、4h 后用300mmol/L D 2氨基葡萄糖处理30m in,P BS 洗涤后继续培养48h 。用细胞消化液消化收获病毒 ,-20保存。115细胞总基因组的提取采集病猪的肺脏和淋巴结。取50mg 剪碎后加入4倍体积的10×P BS 研磨匀浆。匀浆液转移至115mL 离心管中,反复冻融3次后,按DNAZol Reagent 试剂盒说明提取核酸,最后核酸用200L 的8mol/L Na OH 溶解,-20保存备用。116套式PCR第1次PCR 扩增:25L 体积反应体系(10×Buffer 215L,Mg 2+115L,d NTP 2L,引物p1、p2各015L,rTaq 酶

13、012L,模板3L,用灭菌超纯水补足25L ,PCR 扩增条件:95变性5m in;按9445s,531m in,721m in,共进行30个循环;72延伸10m in 。最后置4保存。第2次PCR 以第1轮扩增产物为模板,扩增条件相同。117特异性试验以PCV2毒株(AY556473、PC V1、PRRS V 、PRV 和PP V 感染细胞,提取的细胞总基因组为模板,进行套式PCR 扩增。同时设阴性对照。PCR 产物进行回收纯化,然后送上海生工测序,测序结果上Genbank 进行序列同源性比较。118敏感性试验提取细胞毒(AY556473的总基因组,经紫外分光光度计测得DNA 含量为100m

14、g/mL,然后按10倍梯度倍比稀释到10-9mg/mL 。以此为模板进行PCR 扩增。119样品检测从10个省份采集的899份样品中提取DNA,用套式PCR 方法进行检测。2结果与讨论211特异性试验结果2次PCR 扩增后的产物经1%琼脂糖凝胶电泳观察,发现只有PC V2病毒(AY556473在220bp 附近有一条与预计大小相符的条带,而PC V1、PRRS V 、PRV 、PP V 和阴性对照都没有条带(图1。PCR 产物经回收直接送上海生工测序,测序结果登陆Genbank 进行序列比较,结果表明所得到的片段与Genbank 收录的PC V2相应片段的同源性在96%以上。M.marker

15、(DL 2200016.分别为PCV2、PCV1、PRRS V 、PRV 、PP V 和H 2O 的PCR产物图1套式PCR 特异性试验212敏感性试验结果第1轮PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳观察,发现阳性病毒DNA 稀释度从10-110-5扩增产物在647bp 附近有一条与预计大小相符的条带;第2轮PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳观察,发现病毒DNA 稀释度从10-310-8mg/mL 时扩增产物在220bp 附近有一条与预计大小相符的条带(图3、图4。M.marker (DL 2200016.分别为10-110-6倍稀释的阳性病毒DNA 的PCR 产物图2第1轮PCR 敏感性试验M.ma

16、rker (DL 2200017.分别为10-310-9倍稀释的阳性病毒DNA 的PCR 产物图3第2轮PCR 敏感性试验14畜牧与兽医2006年第38卷第12期兽医基础蕨麻多糖对小鼠脾脏淋巴细胞NAD PH氧化酶活性的影响张霞1,2,胡庭俊2,郑荣梁3,4,程富胜2,陈炅然2,孟聚诚2,高芳2,刘英13 (11甘肃农业大学生命科学技术学院,甘肃兰州730070;21中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所,甘肃兰州730050;31兰州大学生命科学院,甘肃兰州730000;41上海高校一氧化氮及炎症医学E2研究院,甘肃兰州730000摘要:为探讨蕨麻多糖对体外培养的小鼠脾脏淋巴细胞NADPH氧化酶

17、活性的影响,作者应用超氧阴离子荧光探针HE标记脾脏淋巴细胞后,借助激光扫描共聚焦显微镜,对脾淋巴细胞内HE荧光强度的变化进行了检测。结果经H2O2诱导处理的脾细胞中NADPH氧化酶活性显著降低,蕨麻多糖能使脾淋巴细胞内荧光强度增强。表明蕨麻多糖(P AP能够拮抗由H2O2引起的酶活性降低,促进细胞NADPH氧化酶的活性的恢复,从而影响免疫细胞呼吸爆发功能。关键词:蕨麻多糖;脾脏淋巴细胞;NADPH氧化酶;呼吸爆发;HE荧光探针中图分类号:S86511文献标识码:B文章编号:052925130(20061220042203蕨麻(potentilla anserine L为蔷薇科委陵菜属植物,其根

18、又名戳玛、卓老洒曾、人参果、延寿果和仙人果等,为补益类藏药,为藏医常用药之一。据文献记载,蕨麻中含有鞣质、糖类、蛋白质、脂肪酸及委陵菜甙等化学成分,其药理作用在于提高机体免疫力、抗衰老、耐缺氧和止泻抑菌。本文通过测定加入蕨麻多糖(Potentilla anserine polysaccharide,P AP后收稿日期:2006201216基金项目:国家自然科学基金项目(30371056作者简介:张霞(19722,女,副教授,博士。3通讯作者。体外培养的脾淋巴细胞内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸盐(N icotinom ide adenine dinucleotide phos phate,NADPH

19、氧化酶活性的变化,探讨蕨麻多糖对免疫细胞呼吸爆发等生物活性的影响。1材料与方法111材料实验药物:蕨麻多糖由中国农科院兰州畜牧与兽药研究所新兽药工程研究室提取、分离和纯化。实验动物:昆明系小鼠,体重1822g,雄性,健康;由甘肃省肿瘤医院实验动物中心提供。213临床样品检测从山东、福建和河北等10个省份采集的899份临床发病猪淋巴结和肺脏样品中,检出阳性样品329份,平均阳性检出率为3616%。各省阳性检出率分别为:山东6012%、福建3417%、浙江18%、甘肃3413%、湖南2116%、辽宁2012%、黑龙江3313%、湖北2711%、河南5017%和河北4617%。其中山东省高达6012

20、%,最低的辽宁省也有2012%的阳性检出率,西北地区的代表省份甘肃省也有3413%阳性检出率。这表明PC V2感染在全国发病猪群中普遍存在。本研究建立的套式PCR的特异性好。同时,10-8mg/mL 浓度的DNA经套式PCR扩增,还可得到阳性结果,说明该法的敏感性高。该方法的建立,为我们接下来在健康猪群中进行PCV2感染情况、猪用疫苗PCV2的污染情况、实验室和疫苗生产厂家细胞PC V2污染情况的调查奠定了实验室基础。参考文献:1Lukert P D,de Boer G F,Dale J L,et al.The circoviridaeA.Mur phy F A,Fauquet C M,B i

21、shop D H L,eds.V irus taxonomy.6th Report of the I nternati onal Comm ittee Taxonomy of V irusesC.V ienna and New York:Sp ringer2Verlag,1995,1662168.2Tischer I,Rasch R,Tochter mann G.Characterizati on of papovavirusand p icornavirus2like particles in per manent p ig kidney cell linesJ.Zentralbl Bakt

22、eri ol,1974,226:1532167.3Tischer I,M ields W,Wolff D,et al.Studies on ep ide m i ol ogy andpathogenicity of porcine circovirusJ.A rch V ir ol,1991,(324:2712276.4A llan GM,Mc Neilly F,Cassidy J P,et al.Porcine circovirus2exper2i m ental infecti ons of col ostrum s dep rived p iglets and exa m inati on ofp ig f oetal materialJ.VetM icr obi ol,1995,44:49264.5A llan GM,Mc Neilly F,Kennedy S,et a