热休克蛋白32在脑缺血再灌注损伤中的作用

1、热休克蛋白32在脑缺血再灌注损伤中的作用                       作者：袁野 郭建增 杨俊卿 何百成 周岐新【摘要】  目的 探讨热休克蛋白32，即血红素加氧酶1（HO1）在脑缺血/再灌注(I/R)损伤中的作用。方法 实验用雄性级纯种NIH小鼠75只，随机分为假手术组、I/R组、热休克I/R组，每组25只。抽取并回输约40%总血量加双侧颈总动脉夹闭20 mi

2、n建立I/R损伤模型。Western印迹检测HO1蛋白表达；分光光度计法检测HO1和黄嘌呤氧化酶（XOD）活性及丙二醛(MDA)和活性氧(ROS)含量；TUNEL法检测细胞凋亡。结果 热休克I/R组HO1表达（0.31±0.007）和HO1活性（3 854.8±293.8）pmol·mg-1·h-1）高于I/R组（0.20±0.011，2 981.8±212.7）pmol·mg-1·h-1（P0.05）；热休克I/R组细胞凋亡、XOD活性、MDA和ROS含量低于I/R组（P0.05）。结论 HO1表达升高对脑I/R

3、损伤具有保护作用，其机制与抗氧化应激有关。 【关键词】  热休克蛋白32；脑损伤；缺血再灌注；氧化应激    【Abstract】  Objective  To investigate the effects of heat shock protein 32(heme oxygenase 1, HO1) on brain damage induced by cerebral ischemia/reperfusion(I/R). Methods  Cerebral I/R model was established by dr

4、awing out and reperfusing 40% of the whole blood volume in combination with clamping the carotid arteries for 20 minutes. The activities of HO1 and xanthine oxidase (XO)，the levels of malonaldehyde (MDA) and reactive oxygen species (ROS)，neuron apoptosis，and the expression of HO1 protein were determ

5、ined by spectrophotometer，TUNEL method，and Western blot，respectively. Results  The increased HO1 expression and HO activity was observed in heat shock I/R group (0.31±0.007), (3 854.8±293.8) pmol·mg-1·h-1, compared with those in I/R group (0.20±0.011), (2 981.8±212

6、.7) pmol·mg-1·h-1 (P0.05). The XO activity, MDA and ROS levels, as well as cellular apoptosis were lower in heat shock I/R group than those in I/R group (P0.05). Conclusions  The upregulation of HO1 can protect neurons from the damage caused by cerebral I/R. The mechanisms may be rela

7、ted to the properties of HO1 against oxidative stress.    【Key words】  Heat shock protein 32；Brain damage；Ischemia/reperfusion； Oxidative stress     脑缺血/再灌注（I/R）损伤是威胁中老年人健康的高危因素，目前尚缺乏有效的治疗手段1。研究发现热休克蛋白32，即血红素加氧酶1（HO1）在脑内广泛分布,其表达可被I/R诱导升高2。离体实验研究显示,HO1基因敲除神经元对氧

8、化应激损伤敏感性增加，HO1表达上调可增加神经元对氧化应激的耐受性3，4。然而近期有报告显示,HO1过表达可加重多巴胺能神经元氧化应激损伤5。显然脑氧化应激损伤时HO1表达增高的意义有待阐明。同时鉴于有关HO1在神经元氧化应激损伤中作用的研究多采用细胞体外培养模型完成，与在体情况有较大差距。本研究拟采用本室建立的I/R损伤小鼠模型6，以不同预处理干预HO1的蛋白表达和活性，观察HO1对I/R所致脑损伤的影响，探讨HO1在I/R的作用和意义。    1  材料与方法    1.1  动物  雄性级纯种NIH

9、小鼠75只，鼠龄10个月，体重2428 g（重庆医科大学实验动物中心提供），随机分为假手术组、脑缺血再灌注组（I/R组）、热休克I/R组，每组25只。         1.2  方法    1.2.1  主要试剂  6磷酸葡萄糖、氯化正铁血红素、还原型辅酶、6磷酸葡萄糖脱氢酶、Pepstatin和Aprotonin（购自美国Sigma公司）；Leupeptin（购自美国Amresco公司）；兔抗鼠HO1多克隆抗体（购自美国Oncogene公司）；BCA蛋白定量试剂盒

10、（购自美国HyclonePierce公司）；原位细胞凋亡检测试剂盒（购自美国Roche公司）；考马斯亮蓝蛋白定量、活性氧(ROS)测定试剂盒、丙二醛(MDA)测定试剂盒、黄嘌呤氧化酶(XOD)（试剂盒购自南京生物建成生物工程研究所）。    1.2.2  热休克模型  清醒小鼠置42水浴环境中湿热12 min（玻璃罩封盖导热容器，内部水深2.5 cm）。    1.2.3  脑I/R模型  于热休克16 h后建立I/R模型。参照本室李梨6方法进行，简述如下：以4 g/L水合氯醛400 mg/kg

11、腹腔注射麻醉小鼠，仰卧固定。手术分离双侧颈总动脉和右侧颈总静脉。以导管经颈总静脉向心脏方向插入，缓慢抽取相当于小鼠理论血量的40（25 g小鼠抽血0.83 ml）。以无创血管夹夹闭双侧颈总动脉。20 min后松开双侧血管夹，缓慢回输血液。结扎右侧颈总静脉，缝合创口。假手术组麻醉后手术分离双侧颈总动脉和右侧颈总静脉，暴露20 min后缝合创口。    1.2.4  HO1活性测定  I/R 30 min后取海马。参照Balla7方法进行，简述如下：分离海马，加3倍体积匀浆缓冲液（0.01 mol/L蔗糖，0.01 mol/L TrisHCl， 0

12、.000 1 mol/L EDTANa2，pH 7.4），4匀浆；4超声处理30 s；18 800 r/min，4离心15 min；取上清0.2 ml，加反应混合液0.8 ml（2 mmol/L 6磷酸葡萄糖，0.2 U 6磷酸葡萄糖脱氢酶，20 mol/L氯化正铁血红素，2 mg大鼠肝胞质，0.8 mmol/L还原型辅酶）。酶促反应在加入还原型辅酶后开始计时，37避光反应1 h。加预冷氯仿1 ml终止反应并抽提生成的胆红素。5 000 r/min离心20 min，分离有机相。波长480 nm比色，氯仿调零（胆红素消光系数40 mmol/cm）。考马斯亮蓝蛋白定量。  &#

13、160; 1.2.5  Western印迹检测HO1蛋白表达水平  I/R 30 min后取海马。100 mg组织:1 ml裂解液缓冲液（10 mmol/L TrisHCl，0.15 mol/L NaCl，1%NP40，1%脱氧胆酸，0.1%SDS，1 mg/L Leupeptin，1 mg/L Pepstatin,1 mg/L Aprotonin，10%PMSF）的比例，4冰浴匀浆，超声破碎，12 000 r/min离心30 min，取上清BCA法蛋白定量，把样品调成相同浓度，待用。取蛋白样品（40 g总蛋白/泳道），12SDSPAGE电泳（积层胶20 mA，分离胶100

14、 V）后电转移（100 V，2 h）至PVDF膜上。5脱脂奶粉封闭2 h，按1200的浓度加入一抗，37 孵育2 h，洗3次，每次5 min，11 000的浓度加入二抗，37 孵育1 h，洗膜5次，每次5 min，化学发光试剂反应2 min，发光成像仪取像并测定条带灰度值。用Quantity!One图像分析软件进行分析。以HO1灰度值与actin灰度值比值表示蛋白表达水平。比值越大，则蛋白表达越高。    1.2.6  ROS、MDA、XOD活性检测  I/R 31 min后取大脑皮层和海马并参照试剂盒使用说明书进行测定。  

15、;  1.2.7  TUNEL法原位检测细胞凋亡及图像分析   I/R 3 d后取材，切片。参照试剂盒方法进行TUNEL染色，同时设立阳性对照组（加DNase10 mg/L）和阴性对照组（不加TdT）。每只小鼠选取3张切片，在400倍光镜下，从海马随机选取3个视野，将其图像扫描存入计算机，用图像分析系统测得每个视野阳性细胞的平均光密度值，3张切片各个视野光密度值的平均值表示海马神经元的凋亡水平。    1.3  统计学处理  数据用x±s表示，采用SPSS12.0软件进行单因素方差分析,组间比较

16、用LSDt检验。         2  结  果    2.1  不同预处理对海马HO1活性的影响  假手术组、I/R组和热休克I/R组HO1活性分别为（2 320.7±302.7）、（2 981.8±212.7）、（3 854.8±293.8）pmol·mg-1·h-1，I/R组、热休克I/R组显著高于假手术组（P0.05），热休克I/R组显著高于I/R组（P0.05）。   

17、; 2.2  不同预处理对海马HO1蛋白表达的影响  假手术组、I/R组和热休克I/R组HO1蛋白表达分别为0.11±0.005、0.20±0.011、0.31±0.007，I/R组、热休克I/R组显著高于假手术组（P0.05），热休克I/R组显著高于I/R组（P0.05）（图1）。    2.3  不同预处理对I/R脑氧化应激功能的影响  与假手术组相比，I/R组显著增加MDA和ROS含量及XOD活性(P0.01)。热休克预处理显著抑制I/R引起的MDA和ROS含量及XOD活性增加(P0.01

18、)(表1)。表1  不同预处理对I/R脑氧化应激功能的影响(与假手术组比较：1）P0.01；与I/R组比较：2）P0.01    2.4  不同预处理对海马神经元凋亡的影响  假手术组、I/R组和热休克I/R组细胞凋亡水平分别为0.118±0.026、0.324±0.024、0.254±0.026，I/R组、热休克I/R组显著高于假手术组（P0.05），热休克I/R组显著低于I/R组（P0.05）（图2）。    图2  不同预处理对海马细胞凋亡影响 (TUNEL

19、×400)    3  讨  论    脑血管意外致脑损伤与脑I/R有密切的关系已成共识8。因此，建立尽可能近似于临床实际的脑血管意外模型是研究脑损伤机制和开发脑保护剂的基础。我们采用抽取40%全血合并夹闭双侧颈总动脉，再回输血液的方法建立脑缺血再灌致小鼠脑损伤模型具有方便，变异小，重现性高，可用于急性和慢性脑损伤研究等优点7。    目前普遍认为I/R脑损伤机制与脑氧化应激反应增强，脂质过氧化和自由基增加，而机体抗氧化应激系统不能有效抵御增强的氧化应激反应有关9。MDA、X

20、OD和ROS代表了脂质过氧化程度和自由基生成水平。为此，本研究测定了这些指标以评估I/R致脑氧化应激的状况和HO1表达及活性变化对氧化应激致脑损伤的影响。    实验结果显示，采用本研究的I/R方法显著增加脑组织MDA含量和ROS、XOD活性，增加细胞凋亡，同时促进HO1表达和HO活性升高；提示I/R使脑内氧化应激反应明显增强。热休克预处理可进一步诱导HO1表达显著升高和HO1活性增加，抑制I/R致MDA含量，ROS、XOD活性和细胞凋亡增加。提示HO1参与了机体抗I/R所致氧化应激反应，由此减轻了脑损伤程度。    HO1催化血红素降解产生胆绿素、Fe2+和一氧化碳。胆绿素是强的抗氧化剂，可直接清除氧自由基，抑制脂质过氧化10。有报道认为，胆绿素是生理条件下的神经保护剂11。这可跑与HO1表达增加能