浅论腺病毒穿梭质粒pShuttle CMV- +VEGF121-IRES-hrGFP-1的构建和鉴定

1、浅论腺病毒穿梭质粒pShuttle CMV- +VEGF121-IRES-hrGFP-1的构建和鉴定 【摘要】 目的 构建腺病毒穿梭质粒pShuttle CMV-+VEGF121-IRES-hrGFP-1，为构建表达具有抗原表位标记的血管内皮生长因子121(vascular endothelial growth factor 121,VEGF121)，并同时表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)报告分子的腺病毒真核细胞表达载体打下基础。方法 对目的基因供体质粒pTG19T-VEGF121携带的VEGF121基因测序和序列内部存在的限制性内切酶识别位点进行

2、分析，利用PCR(Polymerase Chain Reaction，PCR)技术对pTG19T-VEGF121携带的VEGF121基因突变，以去除翻译终止密码子后的基因序列并在序列前后分别添加新的NotI和XhoI酶切位点。将突变后的VEGF121基因(+VEGF121)定向连入腺病毒穿梭质粒pShuttle CMV-IRES-hrGFP-1，通过电泳和测序鉴定获得的重组质粒。结果 重组质粒经电泳和测序鉴定为正确克隆。结论 成功构建了pShuttle CMV- +VEGF121-IRES-hrGFP-1。 【关键词】 腺病毒穿梭载体;血管内皮生长因子121 Abstract: Objecti

3、ve To clone vascular endothelial growth factor 121 (VEGF121) gene into the adenovirus shuttle plasmid pShuttleCMV-IRES-hrGFP-1, preparing for construction of a novel recombinant adenovirus vector expressing the VEGF121 fused to FLAG epitope and humanized Renilla reniformis green fluorescent protein

4、1(hrGFP-1) as a reporter on the same transcript. Methods The VEGF121 gene contained in the plasimid of pTG19T-VEGF121 was sequenced, and the profile of restriction endonuclease sits existing in the sequence was analysed. Then the translation stop codon TAG was removed. Meanwhile, NotI and Xho I rest

5、riction sites were added before the start codon and after the 3end of the mutant through polymeras chain reaction (PCR) mutagenesis technology. The mutant of VEGF121 gene(+VEGF121 gene) was ligated into the multiple cloning sites of the adenovirus shuttle plasmid pShuttle CMV-IRES-hrGFP一1by the dire

6、ctional cloning method. To identify the correct recombinants the analysis of sequencing and electrophoresis was adopted. Results The electrophoresis and sequencing map of the recombinant accorded with theoretic analyses of pShuttle CMV-+ VEGF121-IRES-hrGFP-1. Conclusions The adenovirus shuttle plasm

7、id pShuttle CMV- VEGF121-IRES-hrGFP-1 has been constructed successfully.Key words:adenovirus shuttle plasmid; vascular endothelial growth factor 121(VEGF121)在骨组织的胚胎发生或骨损伤愈合的过程中，缺乏良好的血供将导致骨生长异常和骨愈合不良。临床植骨修复缺损时，要求植骨床具有丰富的血供，而自体骨移植时，也常通过带血管蒂或带肌瓣增强血供，促进移植骨早期成活。因此，一个较为完善的血管网对于骨形成是非常必要的，它不仅能提供营养和氧气，还能输送成骨

8、前体细胞，分泌成骨细胞所需的生长因子1。在众多已发现的诱血管生成的因子中，血管内皮细胞生长因子(VEGF)被公认为是作用最强，特异性最高的一种，这个细胞因子本身也和骨形成有着直接密切的关系3-5，在各类成骨的活动中起着积极的作用。血管内皮细胞生长因子在体内通过选择性剪切mRNA编码序列可产生六种不同的异构体，其中其中以VEGF165和VEGF121的作用最为显着，但由于VEGF165以一半可溶性，一半不可溶性蛋白在机体内表达，可分泌到细胞外，但一部分与细胞膜或细胞间质结合，而VEGF121则全部为可溶性，不结合于肝素的弱酸性蛋白质，完全分泌到胞外并游离于细胞间质，可以更好的发挥旁分泌的作用，促

9、进血管生成。本实验利用hrGFP-1为报告基因，构建含VEGF121和hrGFP-1基因的穿梭载体，为进一步研究VEGF121在体内的表达和促血管生成及成骨的活动打下基础。1 材料和方法1.1 材料1.1.1 质粒和菌株 pTG19T-VEGF121质粒购自上海东方肝胆外科研究所;腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV-IRES-hrGFP-1购自Stra-tagene公司;pMD19-T和大肠杆菌感受态DH5购自TaKaRa公司。1.1.2 主要试剂、试剂盒 各种限制性内切酶、DNA Ligation Kit Ver.2.0、高保真DNA聚合酶、Agarose Gel DNA Purific

10、ation Kit Ver.2.0、TaKaRa DNA Fragment Purification Kit Ver.2.0 质粒小量提取试剂盒、dNTP、DL15000等购自TaKaRa公司。1.2 方法1.2.1 VEGF121基因的突变及携带突变后VEGF121基因(记作 +VEGF121)的pMD19-T质粒的亚克隆：以pTG19T-VEGF121为模板利用PCR技术突变VEGF121基因以去除VEGF121基因中终止密码子TAG序列，之后在基因序列前后分别加入NotI和XhoI酶切位点：引物序列F:5-GCGGCCGCATGAACTTTCTGCTGTCTTG-3R:5-CTCGAGC

11、CGCCTCGGCTTGTCACATT-3以pTG19T-VEGF121为模板，进行PCR反应，反应条件：98 ，10 s,30 cycles;55 ,5 s,3030 cycles;72 ,30 s,30 cycles;72 ,5 min,1 cycles，琼脂糖凝胶电泳鉴定。PCR产物加“A”和纯化：切胶回收PCR产物，然后进行加“A”反应，然后使用TaKaRa DNA Fragment Purification Kit Ver.2.0进行精制。连接,转化,筛选阳性克隆:使用TaKaRa DNA Ligation Kit Ver.2.0中的Solution I将PCR产物与pMD19-T质

12、粒连接。转化感受态细胞，涂平板，37 过夜培养。提取质粒及测序。 1.2.2 穿梭质粒pShuttle CMV- +VEGF121-IRES-hrGFP-1的构建及鉴定质粒pMD19-T-+VEGF121和穿梭载体pShuttle-CMV-IRES-hrGFP-1分别进行NotI和XhoI双酶切。pMD19-T-+VEGF121反应条件：pMD19-T-VEGF121(约200 ng/L)5 L 10H Buffer 5 L 0.1%BSA 5 L Not I(10 U/L) 1.5 L Xho I(10 U/L) 1.5 L dHO Up to 50 L 37 4 hours。pShuttl

13、eCMV -IRES-hrGFP-1反应条件pShuttle-IRES-hrGFP-1(约50 ng/L) 20L 10H Buffer 5 L 0.1%BSA 5 L Not I(10 U/L) 1.5L Xho I(10 U/L) 1.5 L dH2O Up to 50 L 37 16 hours琼脂糖凝胶电泳，切胶回收后,按摩尔比101混合，加入T4 DNA Ligase 和buffer,16过夜反应，次日转化入感受态细菌DH5,涂布平板，37 过夜培养，筛选阳性克隆。经测序鉴定目的基因以正确的阅读框插入穿梭载体。2 结 果2.1 穿梭质粒pShuttle CMV-+VEGF121-IR

14、ES-hrGFP-1的电泳结果：可见介于7500bp和10000bp的 pShuttle CMV- +VEGF121-IRES-hrGFP-1条带。2.2 pShuttle CMV- +VEGF121-IRES-hrGFP-1测序结果3 讨 论pShuttleCMV-IRES-hrGFP-1是美国Stratagene公司开发的一种新型腺病毒穿梭质粒，具有CMV启动子、多克隆位点和PolyA信号区等真核基因表达所必需的顺调控元件和同源重组序列 并且在多克隆位点后依移计安排了FIAG抗原表位(FLAG epitope，FLAG为人工合成抗原表位， 其氨基酸残基序列DYKDDDDK)基因、内部核糖体

15、进人位点(internal ribosome entry site IREs)和hrGFP-1基因。由于IRES的存在，使插人多克隆位点的目能与GFP基因以双顺反子的形式同时表达。双因表达载体是载体构建新的发展方向，以双顺反子形式表达hrGFP-1报告基因和VEGF121目的基因，能够对VEGF121进行抗原表位标记的腺病毒表达载体可极大的方便VEGF121蛋白表达检测。实验通过PCR技术突变去pTG19T-VEGF121所携带的VEGF121基因序列中翻译终止密码子后的碱基序列，在其前后分别添加NotI和XhoI酶切位点。使基因能够定向连接于pShuttle CMV-IRES-hrGFP-1

16、多克隆位点中的NotI和XhoI之间。去除翻译终止密码子之后碱基的VEGF121基因序列从翻译起始密码子到FLAG抗原表位基因的碱基序列不会导致FLAG抗原表位基因的框移突变，而且由于去除了VEGF121基因的终止密码子，导致两个基因的通读，使两种蛋白融合表达。对后续的VEGF121蛋白表达的特异性检测提供了方便。【参考文献】 1 Peng H,Wright V,Usas A,et al.Synergistic enhancement of bone formation and healing by stem cell expressed VEGF and bone morphogenetic

17、 proteinJ. Clin Invest，2002，110：751-759. Dvorak H,BrownLF,Delmar M.Vascular Permeability factor/vascular endothelial growth factor micro vascular hyperpermeability，and angiogenesisJ.AM/Pathol,1995,146：1029-1039. Mayr-wohlfart U,Waltenberger J,Housser H,et al.Vascular endothelial growth factor stimulates chemotactic migration of primary human osteoblasts J.Bone,2002,30(3)：472-477. Niida S,Kaku M,Amano H,et a1.Vascular endothelial factor can substitute for macrophage colony stimulating factor in the support of esteodastic bone resorptionJ. Exp Med，1999，190(2)：293-298. Engaig M T,Chen O J,Vu T H