浸润性乳腺癌人表皮生长因子受体2基因定量检测标准化的困境和

1、浸润性乳腺癌人表皮生长因子受体2基因定量检测标准化的困境和对策（李挺） 浸润性乳腺癌人表皮生长因子受体2基因定量检测标准化的困境和对策北京大学第一医院病理科李挺21世纪的病理学在肿瘤领域的工作，一方面仍是传统病理学的内容，即做出诊断，寻找肿瘤关键的预后因子，如分级和分期等，以及与外科医生讨论再切除标本的特征。另一方面是病理学的新内容，即快速和准确地进行免疫组织化学和分子标记评估，确定诊断和预测治疗反应。换言之，21世纪的病理医生是为新兴的分子靶向治疗处理至关重要的信息，从而正确筛选患者。现对人表皮生长因子受体2基因（HER-2）定量检测标准化的困境和对策进行简单论述。一、HER-2定量检测分析

2、的重要和严峻性HER-2编码具有酪氨酸激酶活性的生长因子受体跨膜糖蛋白，该蛋白过表达可启动下游信号，刺激细胞生长和转化，与多种癌的发生有关。已有的研究表明浸润性乳腺癌18%20%存在HER-2扩增，而且确定基因扩增是HER-2过表达和相关蛋白激酶异常高水平活性的主要机制1-2。HER-2表达情况不仅与浸润性乳腺癌的不良预后有关，并能预测多种化疗药物及内分泌治疗的敏感性。更重要的是HER-2靶向药物曲妥珠单抗（herceptin）在辅助转移性乳腺癌治疗中发挥了重要作用，1998年美国食品药品监督管理局（FDA）批准其用于转移性乳腺癌的治疗。更进一步的研究和临床实践证明曲妥珠单抗辅助治疗能减少早期

3、乳腺癌的复发危险和病死率，HER-2酪氨酸激酶活性抑制剂药物能改善进展期乳腺癌预后等。因此，目前针对乳腺癌进行HER-2状况检测已成常规。但曲妥珠单抗治疗成本高昂，并存在心脏毒副作用，因而HER-2状态定量检测的准确性非常重要，应达到尽可能高的特异性和敏感性。蛋白过表达检测方法多样，组织和细胞原位的免疫组织化学法（IHC）由于其实用性已在临床病理实验室广泛运用，因此首先被作为HER-2检测的一线技术；基因扩增检测也由于荧光原位杂交（FISH）技术的敏感性和定量性强被临床实验室采用，近年来明场原位杂交方法（如CISH和SISH）也正在逐渐开展。在美国IHC被作为HER-2检测一线技术（IHC3+

4、为HER-2阳性，可接受治疗），而在澳大利亚和欧洲国家，则将IHC和原位杂交（FISH或CISH）同时作为HER-2检测的一线技术。IHC技术虽然有诸多优点，但定量性不强是其不足，同时技术过程也会受到多种因素的影响而有较大差异，这种差异更主要来自于实验室及操作者和观察者主观方面的因素。IHC技术的差异可发生在从组织处理、固定到染色、切片、判读等几乎每一步骤，从而直接影响HER-2检测的准确性。如固定液使用和固定时间，抗原修复方法各异；检测方法可从标准ABC法，采用人工直至多种自动染色系统（Dako、LabVision、Ventana法等）；HER-2抗体多达30多种，不同抗体与抗原的亲和性（敏

5、感性）不同。由于整个技术流程十分繁琐和人工程度高，要完全克服这些差异非常困难。一般来说IHC总是存在潜在的抗原性减弱或丢失，从而产生假阴性（产生于标本处理、固定等过程）和抗原性增强，从而产生假阳性（产生于抗原修复、染色时间控制等）的可能。FISH技术易于定量检测,更不容易受到组织样本和观察者主观因素的影响，使其逐渐成为HER-2扩增检测的金标准，但即使在发达国家仍存在实验室间的差异和检测结果的不一致性。为了增强HER-2定量检测的准确性,减少差异性，国际病理学界进行了大量的尝试和研究, 如制定规范标准化的IHC技术流程,确定染色结果判读标准，建立质量评估认证系统等3。然而包括IHC和FISH检

6、测结果的不准确性仍然存在，实验室间的一致性仅达70%80%4-5，治疗结果也证明有较高比例的假阳性和假阴性6。调查资料表明，即使是使用FDA认证的可靠的商业化抗体,IHC检测的准确率仍然存在问题；实验室间IHC和FISH检测结果的一致性不理想。另一方面，来自临床治疗反应的证据表明：HER-2蛋白过表达同时基因扩增的患者疗效较佳，而仅蛋白过表达、基因无扩增的患者疗效不明显7。鉴于上述问题，美国两大学术机构：美国临床肿瘤学会（ASCO）和美国病理医生学院（ACP）展开了联合调查，并于2007年初在其官方杂志及网站上发布了调查报告和HER-2检测指南8。调查报告分析了大量研究资料，指出在HER-2检

7、测质量控制方面存在的问题，对控制HER-2检测IHC差异性问题提出了新的建议，重新修订了IHC、FISH判读及评分标准，并对质量认证和控制提出了进一步建议。二、我国HER-2定量检测标准化的困境和对策我国文化经济发展不平衡，质量规范体系尚不完善，地方医疗条件有限，而IHC技术则已在全国范围内广泛开展。鉴于西方国家的经验，面对HER-2检测的重要和严峻性，我们建议应广泛开展教育活动，首先让广大病理实验室和医生认识到HER-2定量检测不同于一般免疫组织化学评估，病理在此项评估中所面临的空前挑战、责任和风险。另外建议尽快组织有效的指导机构,制定HER-2定量检测的具体方案和指南，由专家、政府部门、商

8、业公司以及患者代表参与，制定完整的操作框架和体系，组织培训班，建立中心实验室；在IHC方面应该制定实验技术流程规范,推荐抗体选用和结果判读标准；在FISH方面应该提供HER-2扩增细胞系,阳性参考片和技术培训；建立质量认证系统,实施方案，并组织方法间、实验室间、地区间比较研究等。在我国，可能在相当长的时间内IHC仍会是HER-2检测的主要手段，有效控制差异性是其关键，应该通过教育培训、制定细致的操作规程和完善的质量认证系统来逐渐减少差异。有关IHC差异性控制的重要性笔者有以下认识。1组织固定：固定液选择、固定时间(包括及时固定和固定时间)对有效发现抗体有很大影响，在HER-2定量检测中尤其重要

9、。福尔马林固定通过产生蛋白交链，从而形成结构固定,保存组织和细胞的正常形态学，该过程需要在一定时间内完成。固定不足和过固定均会影响免疫反应，过固定可增加蛋白溶解性降解，导致免疫反应丢失，有认为较固定不足的影响更大。固定相关问题已在不同的指南中受到重视，英国国家医疗服务系统（NHS）乳腺筛查计划（BSP）要求外科乳腺切除标本应尽快送交处理，切开,以达到迅速通透性固定；ASCO/ACP HER-2指南推荐采用中性缓冲福尔马林固定液，固定时间648 h，并指出若标本存在固定时间过长或过短，而HER-2染色阴性时应引起注意。尽管固定问题已经引起重视，但国际上在推行IHC标准化检测中，不同实验室间固定情

10、况各异仍是主要问题。2标本情况：随着乳腺癌诊断治疗技术的进步，乳腺癌粗针穿刺活检病理诊断已成术前常规，可对新辅助化疗患者进行全面的术前全面的病理学评估。穿刺组织小有利于快速良好固定。但小组织IHC分析时应注意边缘效应和组织挤压的影响，产生假阳性判断。一般来说石蜡包埋块中组织的蛋白质是稳定的，因此长时间保存后仍可做分析，但有切片后组织中的蛋白质变坏影响反应的证据，尤其是对于细胞核抗原。ASCO/ACP HER-2指南推荐切片后6周内染色为佳。3抗原修复：修复是IHC的重要技术步骤。修复能暴露和恢复经固定修饰后的抗原决定簇，逆转分子间交联，暴露抗原，使其恢复抗原抗体反应。传统的方法有酶消化法。但是

11、近10年来IHC革命性技术进步之一是热修复法的出现,使染色有了质的进步，技术敏感性大大提高。热修复有煮、微波和高压处理，采用缓冲液也有酸碱性、强弱度和离子成分的不同。不同抗体推荐处理方式各异，修复不足是影响染色强度的主要因素，而过度修复则引起阳性过强，修复缓冲液的不恰当使用也可影响结果。4抗体选择：一种肿瘤抗原常有多种商业化抗体，但不同抗体与相同蛋白的亲和性(敏感性)不同，直接影响检测效果。了解它们不同的特异性和敏感性对正确解释结果十分重要。如何选择最佳抗体很复杂，与金标准比较和运用质量保证数据是有帮助的。HER-2定量检测商业化抗体间亲和力的差异性是重要问题，发达国家早就认识到这个问题，经过

12、科学比较研究，认证了几种HER-2抗体。美国FDA认证抗体包括HercepTest (DACO)、4B5 (Vantana)和CB11 (Novocastra)。这些抗体在发达国家广泛使用，但这些抗体多数价格极为昂贵，在我国难以应用。在我们的实践中使用两种非FDA认证的HER-2抗体，一种是兔单抗SP3，另一种是CB11。尽管来自其他发展中国家的研究资料认为SP3有很好的敏感性9。建议结合我国国情，在使用不同HER-2抗体检测结果比较性研究的基础上推荐抗体选择。另外使用抗体应严格遵循推荐的实验指导规程进行，包括抗体稀释浓度，抗原修复方式等。5结果判读：结果判断产生差异的主要的问题有：缺乏质量认

13、证系统，未划定阴性或阳性界限值；缺乏对照，评估结果也缺乏可靠性；另外还有观察者间的差异。2007 ASCO/ACP HER-2指南中，专家组认为原FDA评分系统的特异性不足，另外认为真正的HER-2阳性病例通常阳性细胞比例很高，因而将HER-2阳性（3+）提高为30%细胞以上的分值。新近研究应用FDA和ASCO/ACP两种评分系统，IHC阳性（3+）病例从23%（FDA）减少为16%（ASCO/ACP），而不确定（2+）病例从25%（FDA）增至34%（ASCO/ACP），并应用FISH扩增检测对比综合分析表明，ASCO/ACP评分系统在克服检查者主观因素方面的一致性优于FDA评分系统,因而具

14、有更好的可重复性10。6采用对照：目前在欧美等国已经建立经过标准化，并商业化的高质量阳性细胞系作为对照，而在标准化的中心实验室，每次实验，甚至每张切片均采用阳性对照。应用这些对照材料将非常有利于HER-2检测准确率的改善。但在我国目前要达到这样的水平还有相当的距离，可在实验室内部设置阳性病例作为对照，并每次使用，减少差异。 参考文献1 Yaziji H, Goldstein LC, Barry TS, et al. HER-2 testing in breast cancer using parallel tissue based methods. JAMA, 2004, 291:1972-1

15、977.2 Owens MA, Horten BC, Da silva MM. HER-2 amplification ratios by fluorescence in situ hybridization and correlation with immunohistochemistry in a cohort of 6556 breast cancer tissues. Clin Breast Cancer Inst, 2002, 5:63-69.3 Birner P, Oberhuber G, Stani J, et al. Evaluation of the United State

16、s Food and Drug Administrationapproved Scoring and test system of HER2 protein expression in breast cancer. Clin Cancer Res, 2001, 7:1669-1675.4 Perez EA, Suman VJ, Davidson NE, et al. HER2 testing by local, central, and reference laboratories in specimens from the North Central Cancer Treatment gro

17、up N9831 Intergroup adjuvant trial. J Clin Oncol, 2006, 24:3032-3038.5 Roche PC, Suman VJ, Jenkins RB, et al. Concordance between local and central laboratory HER2 testing in the breast intergroup trial N9831. J Natl Cancer Inst, 2002, 94:855-857.6Perez EA, Roche PC, Jenkins RB, et al. HER2 testing

18、in patients with breast cancer: Poor correlation between weak positive by immunohistochemistry and gene amplification by fluorescence in situ hybridization. Mayo Clin Proc, 2002, 77:148-154.7FDA/CBER. Clinniacal Review Briefing Document sBLA STN: 10379250080TrastuzumbEB/OL.2001-11-05.8 Wolff AC, Hammond ME, Schwarts JN, et al. American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for human e