血基质与H2O2分解萤光剂反应之研究

1、血基質與H2O2分解螢光劑反應之研究研究者：郭婉如 顏羽君指導者：張一知 教授 廖淑芬 老師壹、摘要萃取生物體中的血基質（Heme）與紙中的螢光物。並利用萃取出的物質進行血基質與H2O2分解螢光劑的反應。貳、文獻探討一、血基質美國山迪亞國家實驗室(Sandia National Laboratories)的科學家發現，蛋白質(protein)內的血基質(heme)周圍的化學組成，可能決定蛋白質所能發揮的功能，這項發現，對於研究蛋白質怎樣治療疾病或清理污染物質，幫助很大。血基質是鐵的含氮大環錯合物(如圖一)，是細胞內血紅素蛋白質(hemoprotein)的一部分，在所有細胞內都可以找到血基質；以

2、前，科學家認為血基質的作用只是將蛋白質內鐵質(iron)扣緊在細胞內，讓鐵質執行其生物化學反應 (biochemical reactions)。但現知單單鐵離子無法反應，一定要有含氮之大環作為配位基才會有活性。 除了攜帶氧的功能外，科學家也研究怎樣使用蛋白質的血基質，進行亞硫酸鹽(sulphites) 或亞硝酸鹽 (nitrites)的轉變，使成為氨 (ammonia) 和氫化硫 (hydrogen suphide)，以清理污染物質。 圖一二、色層分析法色層分析法(Chromatography)是俄國植物學家Mikhail Tswett在1903年研究葉綠素化學時所發現的；他利用溶液將色素流經

3、一個填滿細粉狀碳酸鈣的白堊柱，將綠色葉子中的色素分離，這篇論文在1906年才發表。由於葉綠素可以在吸附劑上呈現許多不同的色素，所以把此一操作稱為色層分析法。希臘字Chroma意思為顏色，而graphein為白色。 色層分析法（簡稱為層析法）的原理是使用固定相及流動相。樣品中的各成分藉由流動相的攜帶流經固定相，由於其具有不同的遷移速率因此可以將之分離。層析法有兩種型態，一為管柱層析法，固定相填充於細的管柱內，流動相利用壓力或重力流經固定相；另一種為平板層析法，流動相利用毛細現象或重力作用流經塗抹於平版的固定相。 （一）薄層色層分析（TLC）薄層色層分析（TLC）是將待分離的混合物，溶於適當溶劑中

4、，在TLC板一般為矽膠板之一端近處點滴，置於展層液中，即可將原混合物分離出一連串的小色點，每一小點相當於一種化合物。 （二）液/固相色層分析（LC） 液/固相色層分析是利用吸附作用的色層分析法。吸附體（如矽膠、礬土等）填充在管柱內，樣品混合物再藉由流動的液體推動，經過吸附體而分離。 1.薄層色層分析(TLC)也是液/固相色層分析的一種，由TLC的實驗結果也可推測LC管柱的結果。高性能LC有TLC的優點，也同時具有較佳的定量、易製備分離、樣品易回收、高效率等優點。 2.TLC所用的溶劑和吸附劑的組合，可以應用到管柱分析，結果更快，解析力更強，回收率更高，本實驗LC所採用的溶劑和吸附劑皆與之前的T

5、LC的實驗相同。 3.兩者最大的差異在於：TLC的固定相是藉蒸氣平衡進行吸附，流動相（展層液）則利用毛細作用上升；LC卻是以沖提的方式，吸附體預濕，使流動相在穩定狀態下流入管柱中。 三、螢光光譜儀(Fluorescence Spectrophotometer)（一）用途說明有機物或無機物因激發態性質不同而產生螢光(Fluorescence)或磷光(Phosphorescence)。利用有機物及無機物之此特性，施予一激發光，使該化合物產生螢光或磷光，以便測其含量之光譜儀，稱之為螢光（磷光）光譜儀。（二）應用範圍包括：1.有機物之螢光分析 例如：植物成分、新陳代謝、固醇類、 氨基酸、醯胺酸、 維他

6、命、醫藥或毒劑2.無機物之螢光分析 例如：半導體、天然礦石 3.定量分析同一發光物質在低濃度狀態下，放光強度和濃度成正比，IµC，本實驗的測量皆在此正比區。四、紫外光可見光光譜儀 (UV/VIS Spectrophotometer)紫外光可見光光譜儀偵測波長範圍（190900nm）涵蓋了紫外光及可見光兩部份，可進行定性及定量測定；利用物質之波蜂、消光係數資料及Beer-Lambert定律（吸收度Alog=× l × c），可計算出未知溶液中該物質的含量。Beer-Lambert定律: A : 吸收度I0 : 入射光(incident light)強度I : 穿透光

7、(transmitted light)強度: 消光係數 (單位: cm-1M-1)l: 光路徑長度 (light path,cm)c : 待測樣品的莫耳濃度 (molar concentration,M)參、研究動機螢光劑為一有害物質，但在日常生活中卻被廣泛使用，例如紙張的漂白等等；使用過後的螢光劑隨著工廠廢水直接排出，對環境將造成無法估量的生態環境污染與傷害，目前市面上處理螢光劑的方法，是用次氯酸鈉，但因反應所生成的氯會造成環境二次傷害，所以不是最好的處裡方法，若能找出簡單、便利又廉價的方法分解螢光物質，必能為環境保護盡一份心力。H2O2氧化能力強，可用來破壞螢光劑的雙鍵結構，但其反應速率慢

8、，因此通常需在反應過程中加入催化劑。鐵離子能催化雙氧水反應，分解造成環境污染的螢光劑，但鐵離子本身容易沉澱；生物體中的血基質含有亞鐵離子，且因其包附於 heme(大環含氮的配位基)中，不會沉澱，因此可以萃取血基質，利用其結構中的亞鐵離子作為H2O2反應的催化劑，以破壞螢光劑雙鍵為最終目的。肆、研究目的試從廉價的豬、雞、鴨血液中萃取血基質（Heme），與雙氧水反應以分解造成環境污染的螢光劑。伍、實驗器材與藥劑一、實驗器材燒杯pH計玻棒攪拌器攪拌石滴管TLC片漏斗研缽UV cell管柱層析管迴旋濃縮器各式螢光劑標準Heme豬血丁酮多種有機溶劑二、實驗藥劑液態氮豬血洗潔精HCl甲醇(MEOH)乙酸乙

9、酯(E.A)丙酮(Aceton)異丙醇(lsopropylalcohol)二氯甲烷CH3CN乙醚丁酮(Butaone)己烷(HEX)Heme(藥粉)RhodamineBCoumarin 151THFDMF陸、研究過程一、Heme的萃取（一）將豬血壓碎後立即加入液態氮，使其凝固，再以研缽搗碎。（二）將磨碎的豬血分成兩份放入燒杯中，加入（1）純水（2）純水加洗潔精，再分別置於磁攪拌機上，用磁石攪拌以使細胞膜加速破裂。（三）待其攪拌完成後加入丁酮使其分層。（四）取出中央打破細胞膜後之血紅素層加入酸液（HCl）脫去其蛋白質部分。（五）取出上述的液態物質，利用TLC片找出最適合純化該物質之有機溶劑。（六

10、）抽乾步驟(四)之其他物質，使成為固體以利於保存。（七）將抽乾之血基質溶於THF，洗去其中不必要之有機試料，例如之前為打破細胞膜所加入之洗潔精。（八）多次並分別溶於不同的有機溶劑中，並進行迴旋濃縮以除去與Heme混合在一起的洗潔精。二、螢光劑的萃取（一）用不同的有機溶劑從白紙中萃取螢光劑。（二）用取出之螢光劑進行實驗。（三）使用微量Heme與雙氧水和所得螢光劑進行反應。三、Heme和螢光劑的反應（一）使用各種不同螢光劑與雙氧水反應比較其結果。柒、實驗結果一、血基質的萃取與純化（一）為取得血基質，須找出最易破壞細胞膜的方法，再取其進行下一步驟的實驗。先將燒杯內的碎狀豬血加入 純水 置於 純水+洗

11、潔精攪拌器上進行萃取，以破壞細胞膜，取血基質。萃取後沉澱顯微鏡觀察豬血+純水淡紅色紅血球已破（未有完整之細胞）豬血+純水+洗潔精暗紅色（二）因血基質有溶於有機層，於是加入丁酮。圖 二結果 充分搖晃後靜置會生成沉澱，一週後溶液分3層；用滴管取中間層，滴一滴於清水中，結果可溶於水，顯示血基質尚未萃取出，外層仍有蛋白質包圍。為使蛋白質脫離，於是加酸液（HCl），並調整其pH值範圍在23之間，再加入丁酮。結果 搖晃後沉澱分層，紅色物質出現在有機層。圖三（三）取步驟5之有機層部分進行下列六項檢驗1.TLC色層分析極性比較：異丙醇甲醇丙酮乙酸乙酯己烷分層效果乙酸乙酯無己烷異丙醇在TLC片1/2處出現一分離

12、點甲醇有一不清楚的點丙酮無 討論 異丙醇和甲醇效果較佳，其中以異丙醇較好。決定進行下列步驟 (1) 將異丙醇與甲醇以不同比例混合試驗分析 (2) 將水和異丙醇以不同比例混合試驗分析 甲醇異丙醇附註體積比11無分點效果122131水異丙醇附註體積比11點拖太長，成V字狀12約一個分點討論 (1)濃度太低，看不出效果。甲醇和異丙醇相混合，不明顯。(2)水和異丙醇1比2時，分離效果較佳。結論 取水和異丙醇，以1比2的體積比混合。2.吸收光譜因待測物可吸收可見光，因此下述結果均是以UV長波照射下觀察所得的分離點。圖四萃取物在396nm處有吸收峰，和標準Heme 之光譜非常相似。3.Mass（ESI）I

13、sotope Distribution of Heme 圖五質譜儀（Mass）的結果與電腦模擬圖相似度很高，只是Mass每個吸收峰的數值都較模擬圖高47。質譜中的分子量為663，和Heme 之616不合，原因為電灑質譜ESI的游離方式會造成測片的分子量較大(可能為溶劑附著)，因此需比對同位素分佈。於左邊理論圖和右邊實驗圖兩者之同位素分布比例幾乎一模一樣，推論應為同一物質。 4.測NMR將樣品反覆溶於不同有機溶劑中，並進行迴旋濃縮，待抽真空後送測。其結果訊號雜亂，顯示我們的樣品還不是純物質，決定進行管柱層析。5.管柱層析利用異丙醇無法帶動血基質向下進行分層效果，推論原因，一為所取之血基質留有洗潔

14、精，過於黏稠因此無法被帶動下流；二為所選用之溶劑並非最佳展層液。針對第一項之解決方法，是使用THF溶液沖洗，以期洗去洗潔精；對於二項，則再嘗試其他種有機溶劑或是將溶劑以不同比例混合，以得最佳分離效果。但由於純化的步驟並非實驗要項，因此決定先進行以下步驟，亦即將目前所取出之血基質催化雙氧水，進行打斷螢光劑雙鍵結構的反應。6.測量Heme消光係數（91856cm-1M-1）二、螢光物質的萃取用各種常見的有機溶劑萃取白紙中的螢光物質，再進行TLC片測試，最後進行管柱層析，使螢光部分分離出來。三、Heme和螢光劑的反應（一）在3.5mL的螢光劑中，加入1mL的H2O2，並改變血基質(催化劑)的加入劑量

15、，放置五分鐘測量螢光光譜的吸收情形。下圖為螢光光譜圖，橫軸為波長，縱軸為強度。 圖六局部放大圖圖七 尚未加入催化劑（Heme）之前，雙氧水與螢光劑在五分鐘內幾乎不反應，但加入催化劑之後，螢光急劇減弱，可知其雖並未完全純化但仍有其一定效果。（二）在3.5mL的螢光劑中，加入1mL的血基質(催化劑)，改變H2O2的加入劑量。放置五分鐘測量螢光光譜。下圖為所得之螢光光譜，橫軸為波長，縱軸為放光強度。 圖八 在H2O2逐漸增加的過程中，螢光光譜的吸收強度也有下降的趨勢。(見圖八)（三）取微量Heme(1.7 X 10-6M)當催化劑使用與雙氧水分解自行萃取出螢光劑(3.3 X 10-5M) 取微量he

16、me之實驗結果與大量使用不同，取微量者加入越多雙氧水Emission反而上升。推測是自行萃取出螢光劑的問題，因此改用 Coumarin 151 (螢光劑)實驗。（四）H2O2與微量Heme(1.7×10-6M)分解Coumarin 151(1.2×10-5M)1.H2O2與微量Heme(1.7×10-6M)分解Coumarin 151(1.2×10-5M)的UV光譜圖 在H2O2逐漸增加的過程中， UV光譜吸收強度有下降的趨勢。2. H2O2與微量Heme(1.7×10-6M)分解Coumarin 151(1.2×10-5M)的螢光光

17、譜圖在H2O2逐漸增加的過程中，Coumarin 151的螢光光譜放光強度也呈現上升的趨勢，可得知H2O2增加時，UV吸收的強度逐漸降低而放光強度反而逐漸上升的原因並非為螢光劑的問題。推測是由於螢光劑（自行萃取的樣品和Coumarin 151）和Heme的波長相近，所以在一開始未加入H2O2時，螢光劑因能量傳遞原理會將本身能量傳遞給Heme而使螢光強度先下降，後再加入H2O2時，H2O2除了會緩慢分解螢光劑外，它也會破壞Heme結構，反而讓螢光強度增強。因此進行以下實驗希望找出波長離Heme較遠之螢光劑，看其是否確實能被H2O2與Heme分解。（五）各種螢光劑UV圖 根據所測出之螢光劑UV圖，

18、決定改採波長離Heme(396nm)比較遠的螢光劑(RhodamineB 520nm)進行實驗。（六）H2O2與Heme(210-3M)分解 RhodamineB(1.2*10-3M)局部放大圖Heme確實能與H2O2分解RhodamineB，而且效果比分解自製螢光劑佳。捌、結論一、Heme的萃取（一）將豬血打碎後發現加入液態氮能使其顆粒更細碎，並發現與洗潔精攪拌，其能有最佳破壞細胞膜的效果。（二）取出血紅素加入酸液(HCl)，並調整至pH值23之間，血基質即可與蛋白質脫離。（三）經過Mass與UV光譜的實驗發現與標準血基質（Heme）所得結果圖形相似，僅有分子量上規律的差異，因此判定應是血基質上接了某些元素或離子。（四）根據TLC片色層分析多次實驗發現，以水跟異丙醇以：體積比混合效果最好。二、螢光劑的萃取萃取螢光劑時需先將紙撕碎後依次溶於二氯甲烷、CH3CN、甲醇，進行三次管柱層析即能萃取完成。三、Heme和螢光劑的反應（一）Heme和雙氧水確實可以破壞螢光物質（二）由於螢光劑和Heme的波長相近，螢光劑將因能量傳遞原理將本身能量傳遞給Heme而使螢光強度下降，所以在處裡實驗數據時要特別注意。（