肝硬化门静脉高压症患者肝组织α1肾上腺素受体亚型的mRNA表达

1、    肝硬化门静脉高压症患者肝组织 1肾上腺素受体亚型的mRNA表达        【摘要】目的探讨肝硬化门静脉高压症患者肝组织1肾上腺素受体(1AR)亚型mRNA的表达情况。方法应用半定量逆转录聚合酶链反应法检测12例乙型肝炎后肝硬化肝组织和15例正常肝脏组织中1 AR亚型mRNA的表达。同时逆转录扩增1 AR亚型特异性片段和内参片段，以二者的积分吸光度比值作为该受体亚型的mRNA相对表达量。结果肝脏组织中1a、1b AR亚型的相对表达量对照组(0.86

2、7;0.38、0.23±0.10)均显著高于肝硬化组(0.26±0.12、0.03±0.01，P0.01)。对照组及肝硬化组肝组织中1a亚型的表达量均显著高于1b亚型(P0.01)。两组肝组织中均无1d亚型的表达。结论肝硬化肝组织中1a和1b AR亚型基因表达减少是造成肝硬化时肝脏1 AR蛋白减少的重要原因，对门静脉高压症的形成和维持可能起重要作用。【关键词】肝硬化；受体，1肾上腺素；基因表达；逆转录聚合酶链反应 Expression of 1 adrenoceptor subtypes mRNA in liver tissues of cirrhotic pat

3、ients with portal hypertensionCHEN Lei, ZHU Jiye, LENG Xisheng, et al.The First Surgery Department, The People's Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100044, China【Abstract】 Objective To investigate the expression of mRNA of 1 adrenoceptor (1AR) in liver tissues of cirrhotic patients wi

4、th portal hypertension. Methods Semi-quantitative reverse transcription and polymerase chain reaction (sqRT-PCR) was used to detect the expression of mRNA of 1 AR subtypes in liver tissues in 12 hepatitis B virus-related cirrhotic patients and 15 controls. In these patients routine liver biopsies we

5、re performed. Special 1 AR subtype product and internal standard GAPDH product were both amplified by RT-PCR. The ratio of their integral optical density (IA) was calculated as the relative expression of the 1 AR subtypes.Results The relative mRNA expression of 1a and 1b AR subtype in liver tissues

6、of cirrhotic patients (0.26±0.12,0.03±0.01) was significantly lower than that of controls (0.86±0.38, 0.23±0.10, P0.01). Neither cirrhotic patients nor controls showed 1d AR subtype in liver tissues. The relative mRNA expression of 1a AR subtype was significantly higher than that

7、 of 1b AR subtype in liver tissues of both cirrhotic patients and controls (P0.01). Conclusion The decreased expression of mRNA of 1a and 1b AR may underlie the decrease of 1 adrenoceptor proteins often seen in the liver tissues of cirrhotic patients, and may play an important role in the pathogenes

8、is and maintenance of portal hypertension.【Key words】 Liver cirrhosis; Receptor,1 adrenergic; Gene expressions; Reverse transcription polymerase chain reaction     肝硬化门静脉高压症患者血中肾上腺素、去甲肾上腺素浓度升高1，肝组织中的1肾上腺素受体(1 AR)蛋白数量减少2，应用 AR拮抗剂酚妥拉明后患者的门静脉压力降低3。但是，肝硬化时肝组织1 AR蛋白减少发生于转录还是翻译水平，1 AR亚

9、型的变化如何及其意义目前还不清楚。为此，我们采用半定量-逆转录聚合酶链反应(sqRT-PCR)方法，检测肝硬化门静脉高压症患者肝脏组织中1 AR亚型mRNA的表达。 材料与方法1.标本来源：肝硬化组12例，肝组织取自乙型肝炎后肝硬化门静脉高压症患者。其中男6例，女6例，中位年龄45.6岁，均有乙肝史。对照组为正常肝组织15例，取自无高血压、无肝脏疾患的胆囊疾病或胃肠道肿瘤患者，其中男11例，女4例，中位年龄46.7岁。所有标本均经病理证实。2.逆转录：反应体系20l中含异硫氰酸胍一步法提取的肝组织总RNA 0.5g。随机引物法逆转录cDNA第一链。每个样本都设置不加逆转录酶的阴性对照。3.PC

10、R：(1)引物的设计与合成：采用计算机软件设计3种人1 AR亚型特异性引物。1a上游：5-CAGTCTTCCAAACATGCCCT-3；下游：5-CAGG-AGGATTGGTCTTTGGA-3；(1a cDNA的10481256碱基)扩增片段209bp。1b上游：5-TAGAGGTGCTCGGCTACTGG-3；下游：5-ATGGAGATGACGGTGGACA-3；(1b cDNA的314534碱基)扩增片段221bp。1d上游：5-CAAAGTCTCCAGCCTGTCG-3；下游：5-TATCGGTCTCCCGTAGGT-TG-3；(1d cDNA的15361714碱基)扩增片段179bp。

11、内参GAPDH上游：5-CGGAGTCAACGGATTTGGTGGTAT-3；下游：5-AGGCTTCTCCATGGTGGTAGAGAC-3；扩增片段306bp。所有引物经Genebank检索具有特异性。(2)反应体系及条件：25l体系中含cDNA 2l，25mol/L MgCl2 2l, 5mol/L 4×dNTPs 1l, 1 AR亚型及内参引物各20pmol, 耐高温DNA聚合酶(Taq酶)2U。条件：94预变性300s，94变性40s，58(1a)或57退火(1b及1d)45s，72延伸30s，72后延伸300s，循环30次。每一样本均设置假逆转录产物和蒸馏水为模板的阴性对照

12、。反应结束后作琼脂糖凝胶电泳，紫外线下观察结果并照像。4.结果分析及统计：激光扫描像分析仪测定每一样本目的片段和内参片段的积分吸光度(IA)值，以二者比值做为该样本的mRNA相对表达量。将对照组与肝硬化组的平均IA值作方差分析。结果对照组及肝硬化组肝组织中1a、1b AR的PCR产物的电泳结果见1，各目的片段和内参片段的IA比值见表1。两组cDNA均不能扩增出1d片段。而在同样条件下，该cDNA可以扩增出内参片段；基因组DNA可以扩增出预期的1d AR片段(2)。所有阴性对照均未扩增出特异性片段。表12组病人肝组织1a和1b AR的目的片段与内参片段扩增带IA的比值(<"0 (

13、55 bytes)" src="/med/cano/201003/20100322170058689" 8 9>±s)组别例数1 AR目的片段与内参片段扩增带IA的比值1a AR1b AR对照组150.86±0.38(77%)0.26±0.12(23%)#肝硬化组120.23±0.10(88%)*0.03±0.01(12%)*#     注：与对照组比较，*P0.01；与1a AR比较，#P0.01括号内为1AR亚型所占的百分数   

14、60;注：M：PGEM-7Zf(+)/Hae Markers1、2：阴性对照(1为无模板组；2为RNA作模板组)；3、5：肝硬化组；2、4：对照组。11a、1bAR mRNA在对照组和肝硬化组患者肝组织中的表达    注：M为PGEM-7Zf(+)/HaeMarkers1:RT产物扩出目的片段；2：同一RT产物不能扩增出目的片段；3：基因组DNA为模板扩出目的片段21dAR mRNA在肝组织的表达     讨论 我们使用半定量RT-PCR方法检测1 AR亚型在肝硬化门静脉高压症患者肝脏组织中的表达。以前的研究发现总

15、RNA在400800ng之间，循环次数在40次以下，RNA的扩增量随模板量和循环次数成线性增长4。我们在同一体系中逆转录并扩增一稳定表达的内参基因GAPDH并以两者比值作为mRNA相对表达量，能真实反映基因mRNA的实际表达量。不加逆转录酶的假逆转录产物和不加模板的PCR体系均不能扩增出目的片段，说明PCR产物来源于逆转录产物cDNA而非基因组DNA。用cDNA扩增不出1d目的片段，而在同样条件下却可以扩增出内参片段，且用基因组DNA为模板时可以扩增出1d片段，说明cDNA中不含基因组DNA，还说明没有1d的cDNA，即肝脏组织中没有1d基因的mRNA表达。人们已用RNase保护分析法及竞争性

16、RT-PCR方法检测了1 AR亚型mRNA在正常人肝组织中的表达情况5-8。发现以1a为主(占75%98%)，1b次之(占4%25%)，未检测到1dAR的mRNA表达。本研究结果显示，正常肝组织中1a占77%，1b占23%，与其他方法检测的结果一致。1a、1b亚型的药理学特性不同，在组织中的表达量又不相等，提示它们在肝脏中可能起不同的生理作用。肝硬化时以1a AR的表达为主，提示药物治疗门静脉高压症时可用选择性1a AR亚型拮抗剂。以往的研究发现，肝硬化门静脉高压症患者肝脏组织的1 AR蛋白数量减少2。本研究结果显示，肝硬化时肝组织1a和1b亚型的mRNA显著下降，说明肝硬化时1a和1b AR

17、基因转录的减少是1 AR蛋白减少的重要原因。受体蛋白的减少可能会对肾上腺素、去甲肾上腺素的代谢及效应产生影响，有助于造成肝硬化门脉高压症时二者水平明显升高，门静脉高压症得以形成和维持。基金项目：国家自然科学基金资助项目(39500141)；卫生部科研基金资助项目作者单位：100044北京医科大学人民医院外一科参考文献1，朱继业，杜如昱，冷希圣，等.肝硬门静脉高压症患者血肾上腺素、去甲肾上腺素浓度测定.中华外科杂志，1996，34：144-146.2，冯洪强，冷希圣，张忠明，等.肝硬门静脉高压症病人肝组织中肾上腺素受体的变化.中华医学杂志，1997，77：175-177.3，朱继业，冷希圣，殷军

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