阿糖胞苷上调白血病细胞CD86分子及细胞因子表达的研究

1、阿糖胞苷上调白血病细胞CD86分子及细胞因子表达的研究         11-01-31 09:18:00     编辑：studa20          作者：范冬梅, 杨铭, 贾海荣, 高瀛岱, 王金宏, 纪庆, 熊冬生, 杨纯正【摘要】  目的: 观察阿糖胞苷（AraC）对急性白血病细胞CD86分子表达的影响, 并探讨其作用机制。方法: 流式细胞术(FCM)检测U937、

2、 HL60、 NB4细胞经AraC处理前后CD86分子表达变化, RTPCR检测AraC对各组细胞 CD86 mRNA、 NFB以及细胞因子IFN的表达变化。结果: 经AraC处理的急性白血病细胞CD86分子表达与对照组相比均明显升高（P<0.05）; CD86 mRNA表达水平也明显增强; AraC处理后细胞核内NFB表达明显上调; 并且IFN mRNA在T细胞活化72 h可检测到。结论: AraC能使U937、 HL60、 NB4急性白血病细胞CD86表达增加, 有利于NFB等转录因子活化, 促进CD86转录增强、 表达增加并可有效地增强肿瘤细胞的免疫原性, 激活T细胞, B72在T

3、细胞活化中起着更重要的作用。 【关键词】  阿糖胞苷 NF B CD86 T细胞 细胞因子Abstract  AIM: To observe the effects of Arac on the expression of CD86 molecule on acute leukemia cells and explore the possible mechanisms. METHODS: The expression of CD86 on U937,  HL60 and NB4 cell lines treated with or without AraC

4、0; wa assayed by flow cytometry. The mRNA expression of CD86, NFB, IFN was examined by semiquantitative RTPCR. RESULTS: UPregulation of CD86 was observed on those cells treated by Arac. The leve of CD86 and NFB mRNA in Arac treated cells was significantly  enhanced. IFN was detectable 72 hours

5、after  T cell activation. CONCLUSION: AraC can enhance CD86 and NFB expression on acute leukemia cells,  which may play  critical role in T cell activation and differentiation.KeywordsArac; NFB; CD86; T cell; cytokine在肿瘤免疫反应中, 肿瘤细胞即使表达高水平的MHC和类抗原并存在特异性的肿瘤肽, 在缺乏适宜的共刺激信号时也不能有效地诱导T细胞活化和增

6、殖1 。共刺激信号不是抗原特异性的, 亦不受MHC限制 。 B7/CD28共刺激信号与第1信号协同, 能上调细胞因子的表达, IL2 mRNA转录增加, 使T细胞从细胞周期的G0期进入G1期, 有助于T细胞大量增殖。在T细胞膜上有多种共刺激分子与第2信号产生有关, 例如 LFA1、 VLA4及CD28等, 其中以CD28分子最重要。这条信号通路的作用已在鼠模型中显示, 它证实了B7CD28/CTLA4在自身免疫性疾病, 肿瘤免疫和同种异体排斥反应中的重要作用。B7家族分子（包括B71和B72等）是激发免疫应答的重要协同刺激分子。B72也称CD86, 相对分子质量(Mr)为50000的跨膜糖蛋白

7、, 基因定位于3q21, 属免疫球蛋白超家族(IGSF)成员之一, 主要表达在抗原提呈细胞(APC)上2, 3 。B72既参与T细胞的活化,免疫应答的维持与调节4, 同时也参与细胞介导的免疫应答5。本实验中选用不表达或低表达B72分子的急性白血病细胞作为研究对象, 体外观察经AraC刺激后B72的表达, CD86的上调与核转录因子的关系, 以及在对T细胞介导的特异性细胞免疫中的作用, 为进一步研究急性白血病的发病机制及免疫治疗奠定了实验基础。1  材料和方法1.1  材料  阿糖胞苷（Cytarabine, AraC）购自法玛西亚公司。小鼠抗人 CD86/PE 标

8、记抗体、 小鼠 IgG1 PE标记抗体, 均购自晶美生物工程有限公司。胎牛血清购自中国医学科学院血液学研究所科技公司。TRIzol reagen总RNA提取试剂盒、 RPMI1640培养干粉为Invitrogen公司产品。流式细胞仪为美国BectonDikinson公司产品。1.2  方法1.2.1  细胞株及细胞培养  U937、 HL60及NB4细胞悬浮培养于含100 mL/L的灭活胎牛血清RPMI1640培养液中, 置于50 mL/L CO2, 饱和湿度的37培养箱中培养, 隔天传代培养, 取对数生长期的细胞用于实验。1.2.2  流式细胞术(FC

9、M)检测CD86的表达  收集对数生长期的U937、 HL60和NB4细胞, 调整细胞密度为1×109/L, 加入终浓度为0.25 mol/L的AraC作用72 h, 对照组加入等体积的PBS。收集细胞, 用PBS洗2次, 分别加入PE标记的CD86抗体, PBS洗2次。CD86同型对照为Mouse IgG1 PE标记抗体, 用FCM检测6。激发光为氩离子激光488 nm, 每个样品测定10000个活细胞数。其结果用CELL Quest软件分析。1.2.3  RTPCR测定CD86 mRNA的表达  取对数生长期的U937、 HL60、 NB4细胞, 调

10、整细胞密度,  分别加入终浓度为 0.25 mol/L的AraC作用72 h, 以未加AraC刺激的细胞作为对照组。收集细胞按照TRIzol说明书操作步骤提取细胞总RNA, 取适量DEPC水溶解沉淀, 紫外分光光度计定量。分别各取10 g总RNA, 进行逆转录, 引物由Invitrogen生物技术有限公司合成, 扩增条件为: 94, 40 s, 52, 30 s, 72, 1 min, 30个循环, 行15 g/L agarose凝胶电泳, 扩增产物为488 bp。以actin为内对照。引物序列设计如下: CD86: 上游引物 5GGGGGATCCATGGGCAATCCTTAT3;

11、下游引物 5TCGGGTGACCTTGCTTAGACGTGCAGG3; actin: 上游引物 5CTACAATGAGCTGCGTGTGGC3; 下游引物 5CAGGTCCAGACGCAGGATGGC3。1.2.4  RTPCR分析核转录因子NFB的表达  收集经0.25 mol/L AraC处理72 h的U937、 HL60和NB4细胞以及对照组细胞, 提取细胞的总RNA, 以actin为内对照, 进行逆转录。引物NFB, actin,   均由Invitrogen生物技术有限公司合成, PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后, 紫外透射仪分析图象并拍照。引物序

12、列设计如下: NFB: 上游引物 5ACGATCTGTTTCCCCTCATC3; 下游引物 5TGCTTCTCTCCCCAGCAATA3。1.2.5  RTPCR检测混合淋巴细胞反应中IFN mRNA的表达  将急性白血病细胞U937、 HL60、 NB4用终浓度为0.25 mol/L AraC刺激72 h, 作为混合淋巴细胞培养中的刺激细胞, 用培养基洗1次, 室温2000 r/min, 离心5 min 。台盼蓝染色, 计数活细胞数, 然后用培养基调整细胞密度1×108/L。反应细胞的制备: 常规分离健康人外周血单个核细胞(PBMNC), 用培养基调整细胞密度为

13、1×1010/L, 接种于培养瓶中, 50 U/L白细胞介素2(IL2)培养3 d。收集细胞, 用培养液洗1次, 然后进行活细胞计数, 再用培养基调整细胞密度为4×109/L。将制备好的反应细胞和刺激细胞, 按照一定的效靶比加入6孔培养板中, 设未经处理的刺激细胞和反应细胞作为对照组。于37、 50 mL/L CO2孵箱中继续培养72 h。收集混合淋巴细胞, 提取细胞的总RNA。RT反应合成cDNA第1链的体系25 L, 含有2 g总RNA, 5×AMV逆转录缓冲液4 L, 10 mmol/L dNTP2 L, AMV逆转录酶10 U, 随机引物1 L, 于PCR

14、仪上42反应1 h, 95灭活5 min, 冰上冷却5 min, 置-80保存。PCR反应体系25 L, dNTP(10 mmol/L) 0.5 L, 10×缓冲液2 L, Taq DNA聚合酶1 U, cDNA 2 L, IFN引物各1 L, 以actin为内参照。引物由天津厚普生物工程公司合成。反应条件: 94预变性5 min, 94 30 s, 57 1 min, 72 2 min, 循环35次, 72延伸7 min。PCR产物经20 g/L的琼脂糖凝胶电泳后, 紫外光透射仪分析图像并照相。2  结果2.1  AraC上调急性白血病细胞CD86分子表达  U937、 HL60和NB4细胞经AraC处理72 h后CD86分子的表达较对照组均有不同程度的提高（图1）。说明0.25 mol/L的AraC与细胞作用72 h后能够上调CD86分子的表达。图1  FCM检测0.25 mol/L AraC处理的U937、 HL60及NB4急性白血病细胞CD86分子表达结果（略）Fig 1  The expression of CD86 on ac