鳖甲煎口服液抗肝纤维化作用的实验研究

1、    鳖甲煎口服液抗肝纤维化作用的实验研究        摘要观察了鳖甲煎口服液对实验性肝纤维化的治疗作用。应用四氯化碳复合因素造模后选取血清谷丙转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、乳酸脱氢酶(LDH)活性、透明质酸(HA)、血清白蛋白(ALB)及组织学变化作为测定指标并与秋水仙碱作比较，进行实验。结果表明鳖甲煎口服液与金匮鳖甲煎丸一样对实验性肝纤维化有明显的治疗作用。它能提高血清ALB含量，使ALT、ALP、LDH活性下降，HA含量下降，门脉高压降低，调整免疫功能而使

2、脾重减轻。关键词鳖甲煎口服液肝纤维化实验研究 Exper imental Study on Biejia Jian Oral Liquid's Anti-fibrosis in LiverYao Zhenmin,Xiong Yaokang,Li Jianping(Zhejiang College of TCM,Hangzhou310009)Observe Biejia Jian Oral Liquid's cure to experimental liver fibrosis.After making the model with carbon tetrachloride co

3、mbined factor,take the activities of serum glutamic pyruvic transaminase(ALT),alkaline phosphatase(ALP)and lactic dehydrogenase(LDH),the histological changes,hyaluronidase(HA) and serum albumin(ALB)as the measuring indexes,compared to colchicine,then make the experiment.The result shows Biejia Jian

4、Oral Liquid has the same cure as Biejia Jian Wan to increase the content of Alb,reduce the activities of ALT,ALP and LDH and the content of HA,lower portal hypertension and lighten the heavy spleen through adjusting immunologic function.Key wordsBie jia Jian Oral Liquid,liver fibrosis,experimental s

5、tudy1前言肝纤维化是慢性肝病向肝硬化发展的主要病理变化，是各种慢性肝病发展至肝硬化的中间必经阶段，其特点是纤维结缔组织在肝内的异常增生和沉积，导致肝脏结构的变形，从而引起或进一步加重肝脏功能的损害。因此，能否将病变终止于肝纤维化或逆转至正常，是治疗各种慢性肝病的关键所在。近年来，中医药在抗肝纤维化方面取得了较大成就，近期生存率有所提高，显示了中医药在防治肝硬化方面的光辉前景。鳖甲煎口服液系采用金匮鳖甲煎丸原方所载药物及用量，用现代制剂新技术和新方法，制成疗效确切、便于贮存和服用的口服液新剂型。鳖甲煎丸出自金匮要略，该方具有寒热并用、攻补兼施、行气化瘀、软坚散结之功。原书用治疟病日久而致“疟

6、母”“症瘕”病证。中医认为肝脾肿大属症积范畴，症积日久可致正虚，最终表现为本虚标实的气虚血瘀证。根据“虚则补之”、“实则泻之”的治则，治疗肝硬化当扶正祛邪、活血化瘀、软坚散结。鳖甲煎丸具此功效，但目前对该方的研究仅限于临床病案报道，其药理、药效缺乏现代科学依据，妨碍其推广运用。因此，有必要用现代制剂技术将古方鳖甲煎丸加以剂型改革进行实验研究。旨在阐明中医药抗肝纤维化的作用机制，提高疗效，为中医药的古方新用提供一条新途径，也为开发四类新药提供现代科学依据。2材料和方法2.1.1动物：选用wistar大白鼠80只，雌雄各半，体重220±10g，由上海西普尔必凯实验动物有限公司提供。2.1

7、.2饲料：玉米粉(杭州四季青饲料厂生产)。猪油(市售)。胆固醇(购自杭州医药商场，由广州化学试剂分公司分装)，生产批号：890320。乙醇(购于杭州医药站，产于安徽特级酒精总厂)，生产批号：951010。2.1.3药品：秋水仙碱(法国进口，1mg/片，批号：9585)。鳖甲煎丸(杭州胡庆余堂生产，批号：95051102)。中药鳖甲、蜂房、蜣螂、牡丹皮等21味购于浙江省中医药研究院。鼠妇、硝石购于胡庆余堂药厂。全部中药均经中药系老师鉴别确认。2.1.4试剂：四氯化碳分析纯(由宁波市江东化学试剂厂进口分装)，批号：9406661。橄榄油(由上海卫辉化学试剂厂分装)，批号：930112。2.1.5其

8、它：如注射器、试管等消耗品多购自杭州医药药材公司。2.2方法2.2.1造模方法：除正常组外，于实验第1天均皮下注射四氯化碳分析纯0.5ml/100g体重，以后每隔3天皮下注射40%四氯化碳橄榄油溶液0.3ml/100g体重，共持续5周。正常组皮下注射同等剂量生理盐水。除正常组外，于实验第1天用玉米粉拌入0.5%胆固醇，20%猪油作饲料，用30%乙醇作为唯一饮料。正常组给予普通饲料，饮用自来水，共5周至造模结束。2.2.2分组方法：造模结束时剩40只(其中23只，17只)，随机抽取4只，4只为组(模型对照组)；5只，3只为组(鳖甲煎丸组)；5只，3只为组(秋水仙碱组)；4只，4只为组(鳖甲煎口服

9、液高剂量组)；5只，3只为组(鳖甲煎口服液低剂量组)。2.2.3口服液制备方法把23味中药，按现在通行的中医五版教材方剂学上的用量比例配伍。将炙鳖甲先置容器内煎煮，煮沸20min后，将其余22味中药加入容器内继续煎煮30min过滤。将药渣加3倍量水再煎，煮沸20min，过滤。将所得滤液澄清，再过滤。滤液缩至每ml含生药1g，浓缩液再过滤，将滤液加入等量酒精沉醇36小时，过滤，滤液回收酒精。所得药液加入0.2%苯甲酸防腐，然后高温灭菌10ml安装。     2.2.4用药方法组：每天以同等剂量的生理盐水灌胃1次，持续至实验结束，共4周。组：将鳖甲煎丸制成1

10、5%混悬液，每天按1ml/100g体重灌胃(相当于60kg成人每日每公斤剂量的10倍量)，每天1次，疗程4周。组：秋水仙碱按0.011ml/100mg体重的剂量计算。将所需剂量的秋水仙碱置于乳钵内加水研磨呈混悬状，每天灌胃1次，疗程4周。组：将制备好的鳖甲煎口服液用时浓缩成每ml含生药1.5g，按1ml/100g体重灌胃，每天1次，共持续4周。组：将制备好的鳖甲煎口服液按1ml/100g体重灌胃，每天1次，共持续4周。实验开始后，各组均给予饮用自来水，食用普通块状饲料。为维持病因刺激，各组动物，每周仍按0.3ml/100g体重剂量，皮下注射1次40%四氯化碳橄榄油溶液，至第9周。2.2.5检测

11、指标及方法2.2.5.1大鼠体重及肝脾系数：实验于第9周末结束时宰杀，立即取肝、脾称重。脏器系数=(脏器重量/体重)×100%实验结果见表1。表1治疗各组大鼠体重及肝脾系数(<"0 (881 bytes)" src="/med/cano/201003/20100318190152577" 12 14>±S)组别n体重(g)肝系数脾系数6185.5±22.535.59±0.270.33±0.0128217.5±24.874.32±0.21*0.25±0.016721

12、8.14±25.114.37±0.18*0.26±0.0118241.38±33.254.29±0.14*0.25±0.017217.43±23.364.69±0.110.26±0.11     注：与组比较P0.01，与组比较*P0.01上述数据经q检验处理，大鼠体重除组与组之间有显著性差异外，其他各组间大鼠体重无明显差异。肝系数各组与组比较均有显著性差异，且、组与组比较也有显著性差异，其它各组间无明显差异。脾系数与组比较各组显著减少，提示各给药治疗组肝脾肿大均有

13、减轻，且就减轻肝肿大而言，鳖甲煎口服液低剂量组(组)不及其它3个给药组。2.2.5.2血生化指标：实验于第9周末结束，将大鼠摘眼球取血分离血清，检测血清白蛋白(ALB)、谷丙转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、乳酸脱氢酶(LDH)及透明质酸(HA)。白蛋白用溴甲酚绿法，谷丙转氨酶、碱性磷酸酶、乳酸脱氢酶用酶速率法，透明质酸用HA药盒测定。实验结束见表2。 表2大鼠ALB、ALT、ALP、LDH的变化(<"0 (881 bytes)" src="/med/cano/201003/20100318190152577" 12 14>±

14、S)组别nALB(g/L)ALT(u)ALP(u)LDH(u)631.32±1.29593.17±20.0599.17±11.37365.17±53.48833.75±1.09769.75±9.3357.75±8.61288.5±17.43733.3±1.31476±9.1159.43±14.50283.86±21.43834.65±1.44564.38±6.5753.88±11.59279.13±17.33733.36±1.

15、08874±7.3960.14±9.55289.11±17.74     注：与组比较P0.05P0.01各给药组白蛋白含量与模型对照组比较有显著性差异，其中、组差异极为显著，说明在提高白蛋白含量方面，以鳖甲煎丸和鳖甲煎口服液高剂量组最为明显。谷丙转氨酶测定结果与白蛋白含量相一致。碱性磷酸酶和乳酸脱氢酶含量以模型组最高，明显高于其它各组，经统计学处理有显著差异，但各给药组比较，差异不明显。2.2.5.3组织学检查及判定标准：取肝脏左叶标本以10%福尔马林固定，石蜡包埋，连续切片，HE和LG染色，光镜观察。镜下按以下标准进行半

16、定量或定量检查并计分。(1)肝纤维化：0级(0分)，汇管区无明显纤维组织；级(1分)，汇管区有较多纤维组织增生，局限性；级(2分)，汇管区有大量纤维组织增生，呈窄带状，并向肝小叶周围伸展；级(3分)，汇管区有大量纤维组织增生，呈宽带状，并伸展包绕肝小叶，且见中央静脉偏位现象。(2)肝细胞炎症变化：肝细胞形态分为“-”无变化；“+”少量肝细胞变性；“+”1/32/3肝细胞变性；“?”大量肝细胞变性。实验结果见表3。 表3各组大鼠HA的变化(<"0 (881 bytes)" src="/med/cano/201003/20100318190152577"

17、; 12 14>±S)组别nHA(ng/ml)6383.89±21.908254.21±41.18*7310.99±33.498242.79±34.06*7265.04±36.25     注：与组比较P0.01与组比较*P0.05*P0.01如表中所示：各给药组血清透明质酸含量明显低于模型对照组，有极显著差异。而且鳖甲煎丸和鳖甲煎口服液高剂量组与秋水仙碱组比较，也有显著性差异。 表4肝纤维组织增生情况组别n肝纤维组织增生程度积分<"0 (881 bytes)"

18、src="/med/cano/201003/20100318190152577" 12 14>±S-+600422.33±0.52815201.125±0.64705201.286±0.49825100.875±0.64714101.143±0.69     注：与组比较P0.05P0.01在VG切片上，各组大鼠肝纤维化程度如上表所见。经统计学处理，各给药组肝纤维化程度明显低于模型对照组，而各给药组间差异不显著。详见表4。 表5肝细胞变性情况组别n肝细胞变性程度平均Ri

19、dit值-+600420.1759814300.5625704300.5021815200.6180705200.5674上述等级资料经Ridit分析x2=9.65，P0.05。认为治疗用药与肝细胞变性程度是有关的。结合各组平均Ridit值可见，就改善肝细胞变性而言，以鳖甲煎口服液高剂量组效果最佳，模型对照组效果最差。详见表5。 3讨论3.1肝纤维化实验模型的评价我们采用四氯化碳复合因素造模，四氯化碳系肝细胞毒性药物，可损伤肝脏，产生中毒性药物性肝炎，进而发展为大结节或小结节性肝纤维化、肝硬化，它是实验室中诱导肝纤维化最早使用的毒剂。乙醇对肝脏也有直接毒性作用，可使肝细胞内的线粒体肿胀变形。酒

20、精中间代谢产物乙醛对肝脏的直接损害和降低肝脏对某些毒性物质的抵抗力，以致引起酒精性肝炎，不能满足大鼠的营养供给，食物中长期缺乏蛋白质、维生素和抗脂肝因子胆硷等能引起肝细胞坏死、脂肪肝，直至形成营养不良性肝纤维化。但其直接致肝纤维化的关系尚未阐明，大多认为长期营养失调可降低肝脏对其他致病因素的抵抗力，成为肝纤维化形成的间接病因。四氯化碳复合因素制成的实验性肝纤维化模型与人类酒精性肝纤维化在病理下相接近，与肝炎病毒所致肝纤维化在病因及发病机制上是不同的，但组织学变化是相似的。且此模型周期短，分期明确，在目前肝炎病毒复制肝纤维化模型尚不成熟的前提下，用四氯化碳复合因素造模是较理想的方法之一。本实验造

21、模5周后，经病理观察，肝纤维化复制成功。造模成功后的大鼠明显消瘦，精神萎靡不振，食量明显减少，大便溏泻，皮毛松散，并可见红色出血点，毛发枯黄无光泽，体重明显减轻，与中医虚劳病的表现极为相似。肝纤维化形成后，可出现肝窦增宽，肝内瘀血等微循环障碍现象1，说明此模型与中医正虚血瘀的肝纤维化主要病机特征相符。3.2鳖甲煎口服液疗效分析与作用机理初探3.2.1鳖甲煎口服液对肝纤维化的治疗作用治疗实验结果表明：鳖甲煎口服液有增进动物食欲，改善机体状况，促进生长发育，增加大鼠体重的效果。且能保护网状内皮系统，使肝脾肿大得以减轻。能改善蛋白代谢，而提高白蛋白含量。能明显降低ALT、ALP和LDH的活性，使受损

22、肝细胞功能得到不同程度恢复。能显著降低HA含量，使肝组织结构恢复，保护肝细胞，恢复肝细胞功能。还能减轻肝纤维化程度，从而显示出较好的抗肝纤维化作用。3.2.2鳖甲煎口服液抗肝纤维化的作用机理初探肝纤维化是在各种致病因素作用下，沿着肝细胞变性坏死炎症纤维化这一途径反复发作而形成的2。从实验研究结果观察分析，其作用机理主要体现在以下四个方面：(1)保护肝细胞，防止肝细胞的变性坏死。Gr-essner认为肝实质细胞坏死是肝纤维化的启动因素，病变组织中的被激活的炎细胞及枯否氏细胞所分泌的纤维原性介质起着维持纤维化的作用3。如能有效地保护肝细胞，防止肝细胞变性、坏死，即可阻止炎细胞浸润，肝细胞再生和纤维

23、组织增生，切断向肝纤维化、肝硬化发展的病理过程。实验结果提示：鳖甲煎口服液可保护肝细胞，防止或减少肝细胞损害，恢复变性细胞结构，抑制炎症反应，改善肝功能，使肝实质细胞坏死这一启动因素得以消除或部分消除，而表现出治疗肝纤维化的效应。(2)改善肝脏微循环，增加肝脏血流量。肝纤维化、肝硬化存在着肝脏循环血量减少，肝内血流增加，这主要由于肝细胞肿胀，变性及坏死，引起肝内微循环障碍，血流阻力增加。同时因为肝小叶正常结构和肝内血液循环分别被破坏和改变，肝门静脉循环被阻，肝血流减少，肝内血流阻滞，供血不足，血液充盈困难4。鳖甲煎口服液可能具有改善微循环，加速血流，在全身及局部组织血流改善的基础上，使门静脉血

24、流增加，改善肝脏供血和营养，从而减轻或防止肝细胞变性坏死，使纤维化的肝脏加速修复。现代药理研究证实鳖甲、桃仁等活血化瘀软坚药，可改善门静脉血流及肝脏微循环，促进纤维溶解功能，有利于肝纤维化的修复和肝细胞的再生5。(3)促进肝内胶原蛋白降解，加速纤维组织重吸收。肝纤维化、肝硬化形成后有两种情况，一种可逆性改变，即停止病因刺激后，胶原纤维可被重吸收；一种为不可逆性改变，因其纤维隔较宽，已有玻璃样变，纤维隔含血管少，炎细胞少，故纤维不易被重吸收6。因此，在肝纤维化形成后，如何促进已形成的胶原纤维降解，使纤维组织重吸收，显得尤为重要。HA是结缔组织基质的主要成分，主要由肝内贮脂细胞合成，并由肝脏清除，

25、肝硬化、肝纤维化时血中HA含量明显升高7。一般认为肝病HA升高主要是肝内合成HA增加，内皮细胞分解代谢降低及肝脏对HA清除率下降所致，研究证明，HA水平与反映肝功能损害的指标有显著相关性，并与血清型前胶原肽(PP)呈平行关系8。本实验证实，鳖甲煎口服液能降低HA含量，抑制肝内间质反应和贮脂细胞的活化，从而减少胶原等基质成分的合成，促进其分解，加速肝内新生纤维组织的重吸收，减少肝纤维化的发生和治疗已形成的肝纤维化。(4)调整机体的免疫功能，减少肝细胞的免疫损伤。有人研究发现肝炎后肝硬化的病机主要是肝细胞持续损伤和再生，从而引起结缔组织形成过多，与免疫功能失调有关9。日本学者雨谷荣报道，小柴胡汤可

26、以增加Kupffer细胞的吞噬作用，促使其产生白细胞介素(IL-I)，促进窦内皮细胞分泌血小板活化因子(PAF)，间接抑制免疫反应，从而对肝纤维化的发生发展起作用10。脾脏是人体最大的免疫器官，是合成和分泌抗体的重要场所，有清除异物和自身衰亡细胞的作用。实验结果显示：鳖甲煎口服液组与模型组比较脾脏肿大明显减轻，提示该口服液对体液免疫有调整作用。鳖甲煎口服液中有小柴胡汤的药物组成，具有调整机体免疫功能，减少肝细胞的免疫损伤，改善物质代谢，从而对肝组织起到保护作用。至于抗肝纤维化的详细机制尚有待进一步深入研究。3.3鳖甲煎口服液与秋水仙碱、鳖甲煎丸疗效比较3.3.1与秋水仙碱比较：鳖甲煎口服液高剂

27、量组能明显增加大鼠体重，与模型对照组比较有极显著差异(P0.01)；但秋水仙碱组与模型对照组比较无显著性差异(P0.05)。说明鳖甲煎口服液高剂量组对改善大鼠整个身体状况，增加体重较秋水仙碱为优。就提高血清白蛋白，降低血清谷丙转氨酶活性而言，鳖甲煎口服液高剂量组与模型对照组比较，有极显著差异(P0.01)；而秋水仙碱组与模型对照组相比，仅有显著性差异(P0.05)。说明口服液高剂量组在改善肝功能方面疗效优于秋水仙碱组，特别是透明质酸含量测定，鳖甲煎口服液高剂量组能明显降低其含量，与秋水仙碱组比较，差异极显著(P0.01)，结果提示：口服液高剂量抗肝纤维化作用疗效较秋水仙碱明显。3.3.2与鳖甲煎丸比较：鳖甲煎丸组对大鼠体重影响与秋水仙碱组相似，远不及鳖甲煎口服液高剂量组。但肝系数鳖甲煎丸组比口服液低剂量组疗效为优，有极显著差异(P0.01)，与口服液高剂量组比较无显著性差异(P0.05)，具体数据提示：口服液高剂量组稍优于鳖甲煎丸组。就肝功能指标测定结果分析，口服