Notch信号通路体外和细胞的药物筛选模型的建立和研究

1、Notch信号通路体外和细胞的药物筛选模型的建立和研究钮 琦, 吴 方*(上海交通大学系统生物医学研究院, 上海 200240摘要: Notch信号通路与生物体的发育及多种癌症的发生密切相关, 目前针对Notch信号通路的药物筛选模型均以鼠源Notch蛋白为底物, 未见以人源Notch为底物的报道。本文克隆并表达提纯了人源Notch1截短形式N100, 以之为底物首次构建了Notch信号通路体外和细胞的药物筛选模型。同时, 用已知Notch通路抑制剂对此模型进行了验证, 得到了相应的IC50值。本研究构建的模型能有效应用于人源Notch信号通路的调控剂筛选, 为高效发现靶向Notch通路的调控

2、剂奠定了基础。关键词: Notch信号通路; 癌症; 调控剂; 药物筛选模型中图分类号: R965.1 文献标识码:A 文章编号: 0513-4870 (2014 06-0837-06Establishment of in vitro and cell-based drug screeningmodel for Notch signaling pathwayNIU Qi, WU Fang*(Shanghai Center for Systems Biomedicine, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200240, ChinaAbstract:

3、Notch signal pathway is closely related to the organisms development and a variety of cancers. Current models available for screening modulators of Notch signal pathway all use mouse Notch protein as substrates and those models which use human Notch protein have not been reported. To make the screen

4、 resultsmuch more reliable, the authors cloned a truncated form of human Notch1 called N100, and built the screening models for the use of it instead of mouse Notch protein. The models included an in vitro screening model basedon the purified -secretase enzyme and a cell model using luciferase repor

5、ter system. The screening modelsthen have been verified by the known modulators of Notch signal pathway and the IC50 values have been obtained. The verified models can be used to screen modulators of human Notch signaling pathway effectivelyand it can lay the foundation for finding new modulators of

6、 this kind effectively.Key words: Notch signaling pathway; cancer; modulator; drug screening modelNotch信号通路是一类高度保守、不依赖第二信使的信号通路。它由Notch配体蛋白、Notch受体蛋白及下游的转录抑制蛋白CSL构成。当与相邻细胞上的配体结合后, 细胞膜上的Notch受体蛋白发生构象变化, 从而引起之后的两次水解。其中, Notch受体首先被金属蛋白酶 (TACE 在位于胞外区的S2位点剪切, 产生的C端片段再被分泌酶在跨膜区的S3收稿日期: 2014-01-29; 修回日期: 20

7、14-03-18.基金项目: 国家自然科学基金面上基金资助项目 (31270853.*通讯作者 Tel / Fax: 86-21-34207545, E-mail: fang.wu 位点剪切, 得到的胞内片段进入细胞核, 与CSL结合,参与下游靶基因表达的激活1。Notch信号通路对癌症的影响具有双重性, 在T淋巴细胞白血病 (T-ALL 以及如乳腺癌、大肠癌等多种实体瘤中有致癌作用2; 而在肝癌、头颈鳞癌等中, 通过抑制细胞增殖、促进细胞凋亡等来发挥其抑癌作用2, 3。分泌酶对Notch受体蛋白的剪切作为Notch 信号通路必经的一步, 对Notch信号通路发挥其作用尤为重要。目前已有多种分

8、泌酶抑制剂 (GSI·研究论文·被尝试用来作为抑制Notch信号通路的抗肿瘤药, 如IL-X (cbz-IL-CHO、三肽分泌酶抑制剂 (z-Leu- Leu-Nle-CHO、DAPT、MK0752、RO4929097以及dibenzazepine等。而MK0752则已在复发性、难治的T-ALL以及晚期乳腺癌患者上进行临床I期试验4, 5。一种高效的分泌酶抑制剂RO4929097也已在一些实体瘤患者的临床I期试验中被证明口服有效6。尽管如此, 分泌酶抑制剂将导致所有Notch同源蛋白的剪切被抑制, 而且Notch受体蛋白也不是分泌酶唯一的底物, 因此这类抑制剂类药物会产生如

9、肠毒性这样的副作用4, 6。同时, Notch信号通路在癌症中的双重作用也提示, 不仅要寻找Notch通路的抑制剂, 也应寻找其激活剂以应用到Notch发挥抑癌作用的恶性肿瘤中2。目前已有一些体外或基于细胞的检测分泌酶剪切Notch受体蛋白的酶活力的方法714, 但都采用鼠源Notch作为底物, 且大多数检测活力的方法没有被Notch通路的分泌酶已知抑制剂验证, 因此这些模型具有使用的不确定性和不可靠性。为了解决这一缺陷和更好地发现Notch通路的调控物, 作者克隆了来自人源Notch1的N100 (Notch跨膜区附近的氨基酸; 分泌酶的直接底物, 并首次构建了相应的体外及细胞水平的分泌酶剪

10、切N100模型, 用Notch通路已知抑制剂DAPT和RO4929097对这些筛选模型进行了验证, 在此基础上以此模型去筛选得到的Notch信号通路调控剂将更加可靠和准确。材料与方法质粒与细胞 pcDNA4/TO-C99-GV质粒为瑞士联邦理工大学Fraering Patrick教授赠送; pGL4.31 luc2p/GAL4UAS/Hygro质粒购自Promega公司; pcDNA3.1-hNEXT质粒购自南京金斯瑞生物科技有限公司。感受态细胞TOP10、BL21 (DE3 购自天根生化科技(北京 有限公司。pET-21b质粒和HeLa 细胞为本实验室保存。主要试剂、试剂盒及培养基 M2抗体

11、(识别Flag标签 购自Sigma公司; 1744抗体(识别鼠源Notch1被分泌酶剪切后的1744位点缬氨酸, 也可识别人源 购自Cell Signaling Technology公司。M2 Affinity Gel (M2 beads、DMSO、DAPT均购自Sigma 公司。RO4929097购自Selleck公司。ONE-Glo Luciferase Assay System试剂盒购自Promega公司。DMEM、OPTI-MEM培养基购自Invitrogen公司。人源N100原核表达载体的构建根据文献15的方法, 设计引物, 从pcDNA3.1-hNEXT质粒上扩增人源Notch1的

12、1721位缬氨酸至1819位谷氨酸,共99个氨基酸。在5'端添加Nde I酶切位点及起始密码子甲硫氨酸, 3'端添加flag标签 (DYKDDDDK、终止密码子及Hin d III酶切位点, 即扩增得到的序列为: 5'-CATATG-N100-flag-TAA-TTCGAA-3' (Met与N99合称N100。用Nde I和Hin dIII分别处理此扩增片段和pET-21b质粒, 前者用PCR清洁试剂盒纯化, 后者在琼脂糖凝胶上电泳, 割下目的片段并用胶回收纯化试剂盒纯化。然后将纯化后的两者用T4连接酶连接, 16 过夜, 转化至TOP10感受态细胞。长出菌落后

13、挑取单克隆, 抽提质粒并测序正确, 得到pET-21b-N100flag。人源N100真核表达载体的构建采用Spe I和Xba I两限制性内切酶将质粒pcDNA4/TO-C99-GV 上的C99用N100替换。由于此载体上本身还存在一个Spe I酶切位点, 为避免其对酶切的干扰, 先用基于PCR的方法将此位点定点突变, 再采用与前述构建原核表达载体同样的方法; 将载体和目的片段均用Spe I和Xba I处理, 目的片段用PCR清洁试剂盒纯化, 载体经琼脂糖凝胶电泳后, 割下胶上的大片段(去除了C99的载体, 用胶回收纯化试剂盒纯化; 两者经连接、转化, 挑取单克隆后抽质粒测序, 得到pcDNA

14、4/TO-N100-GV (Spe I位点突变, 再将已突变位点突变回去, 得到最终的pcDNA4/TO-N100-GV。人源N100的表达提纯将pET-21b-N100flag质粒转化适用于原核表达的BL21感受态细胞, 挑取单克隆在5 mL含氨苄青霉素的LB培养基内摇菌过夜, 然后接种于500 mL培养基内扩大培养。当菌液OD 值达到1.0时, 加入IPTG (终浓度1 mmol·L1 在37诱导表达2 h; 4700 r·min1、4离心20 min收集菌体, 加入含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液, 用高压破碎仪破胞: 35 kpsi, 通过2遍。4700 r·

15、min1、4离心20 min收集上清液。取含有M2 beads的溶液1 mL, 装入15 mL离心管中, 加上述细胞裂解液(不含蛋白酶抑制剂 至充满管体, 于旋转摇床上洗涤15 min, 1000 r·min1室温离心5 min, 弃上清液, 共洗涤3次。洗好的beads与破胞后的上清液装入底部铺有一层滤纸的 2 mL 注射器针筒中, 使液体可以通过, 而固体不可以通过。待beads完全沉降后, 在其上方再铺一层滤纸, 防止被液流冲起。向针筒中加入裂解液, 使beads始终保持湿润, 即完成亲和纯化柱的装柱。将破胞后得到的蛋白上清液缓慢加入亲和柱,钮 琦等: Notch 信号通路体外

16、和细胞的药物筛选模型的建立和研究· 839 · 并用裂解液 (不含蛋白酶抑制剂 洗脱杂蛋白 (每遍加入1 mL, 共5遍。再加入洗脱缓冲液, 流出的液体即为目的蛋白。用离心管收集目的蛋白, 每管100 L, 共40管。取第518管样品, 分别在两块12% SDS-PAGE 胶上电泳, 然后一块胶做Western blotting, 另一块胶直接用考马斯亮蓝染色, 鉴定蛋白提纯情况。回收M2 beads 并重生亲和柱。基于分泌酶的N100体外酶切模型的建立及验证 参照文献16中的方法提纯分泌酶纯酶。处理底物: 从上述N100样品浓度最高的一管中取20 L, 加入5% SDS

17、2 L, 65 加热5 min, 13 000×g 离心 2 min, 取上清液待用。处理磷脂酰胆碱 (PC: 取PC100 L, 用含1% Chapso 的Hepes 缓冲液以超声的 方法充分溶解。实验时向500 L 的小离心管内依次加入含0.2% Chapso 的Hepes 反应缓冲液 (按总体积 30 L 算出反应缓冲液体积、分泌酶5 L 、PC 2.5 L 、已知抑制剂及底物N100 0.5 L, 最终总体积为30 L 。此体系在37 反应4 h 后, 用含8% SDS 的上样缓冲液终止反应。本文中以已知的分泌酶抑制剂DAPT 和RO4929097作为阳性对照, 验证了此模型

18、的可行性。其中, DAPT 分别使用了20、10、5、1及0.5 mol·L 1的浓度, RO4929097则分别使用了500、100、50及5 nmol·L 1的浓度。细胞水平的N100剪切模型的建立及验证 取HeLa 细胞, 以细胞数2×105个/孔接种于两块24孔板。24 h 后, 细胞汇合度接近80%, 采用X-tremeGENE HP 转染试剂, 按照其说明书将pGL4.31 luc2p/GAL4UAS/ Hygro质粒与pcDNA4/TO-N100-GV 质粒共同瞬时转染该细胞。16 h 后, 更换新鲜培养基, 两块板分别加入不同浓度的DAPT 或RO

19、4929097处理。DAPT 的浓度分别为5、10及20 mol·L 1, RO4929097为5、50、100及500 nmol·L 1。同时, 每块板均设置多个对照, 包括: 仅转染pGL4.31 luc2p/GAL4UAS/Hygro质粒, 测试细胞是否有本底的、可干扰实验的Notch 表达; 转染空载体pcDNA4/TO 而非带有N100基因的载体, 测试转染试剂或质粒载体对细胞是否存在影响; 加DMSO 处理, 作为抑制剂的阴性对照。每种处理均为复孔。24 h 后, 吸去培养基, 每孔加入裂解液100 L, 室温放置5 min, 取出其中的90 L 移入黑 色不透

20、光的96孔板, 再加入荧光素酶底物90 L, 轻摇混合均匀后用酶标仪读化学发光 (luminescence 值。得到的数值大小与分泌酶剪切N100的活力高低呈正比。统计学处理 体外酶切模型为单孔实验, 数据来自Odyssey 软件根据Western blotting 结果得出的 条带灰度值。细胞水平剪切模型为复孔实验, 数据 来自酶标仪读值, 并计算出相应的平均值及标准差 (standard deviation, STDEV。数据导入GraphPad 软件, 拟合剂量依赖性曲线, 并计算出IC 50值。所有剂量依赖性实验均独立重复了3次。 结果 1 人源N100与鼠源N100的比较Notch

21、信号通路虽然是较保守的信号通路, 但是人源Notch 蛋白和鼠源Notch 蛋白之间还是存在区别的。人源Notch1蛋白全长2 555个氨基酸, 鼠源略短, 为2 531个氨基酸。将UniProtKB 数据库中人源和鼠源Notch1自TACE 剪切后的第1个氨基酸起共99个氨基酸,即N99的序列用NCBI-BLAST 进行比较可知 (图1, 人源和鼠源N100在跨膜区内的第1个氨基酸 (N100上第16个氨基酸 就不相同, 人源为苯丙氨酸, 而鼠源为亮氨酸。且紧邻跨膜区的胞外域十几个氨基酸中也有多处不一致, 总的同源性为95%。为消除这些序列差异带来的评价分泌酶剪切Notch 的调控剂的不确定

22、性, 以人源N100作为分泌酶剪切模型的底物。通过重组载体的构建, 将人源N100基因克隆至pET-21b 载体, 并在大肠杆菌中表达, 再经亲和纯化, 得到了足够量的N100-Flag 蛋白。2 基于分泌酶纯酶的N100体外酶切模型为验证所提纯的人源N100是否能被分泌酶剪切, 构建了以人源N100为底物的基于分泌酶纯酶Figure 1 Amino acid sequence alignment of human N99 and mouse N99 by NCBI Blast·840·药学学报Acta Pharmaceutica Sinica 2014, 49 (6: 8

23、37842的体外剪切模型。从Western blotting结果可知, 当加入DMSO作为阴性对照时, N100下方有1条带, 此条带可被特异识别剪切产物N端的1744抗体检测到(此抗体不识别未剪切的N100, 图2A, 说明此条带即为剪切产物NICD, 人源N100确实可以被分泌酶剪切。当加入已知的分泌酶抑制剂DAPT和RO4929097后, 产物NICD减少, 且这种减少是呈剂量依赖性的(以鼠源N100作底物时, DAPT高浓度下产物的少许增加可能由于实验误差和Western blotting的半定量性导致, 这说明此剪切产物是被分泌酶特异生成的, 可被分泌酶抑制剂抑制。根据GraphPa

24、d软件作图可以算出, DAPT的IC50约为1 mol·L1, Figure 2 Validation of in vitro assay based model with known-secretase inhibitors at different concentrations. Inhibition rate is calculated from grey value of Western blotting band. A: Western blotting result of in vitro assay when using human N100 as substrates

25、 and DAPT and RO4929097 (RO as inhibitors. The membrane was incubated with M2 antibody (image top and 1744 antibody (image bottom, separately. B, C: Inhibition rate of DAPT and RO4929097 when using human N100 as substrates. D: Western blotting result of in vitro assay when using mouseN100 as substra

26、tes and DAPT and RO4929097 as inhibitors. The membrane was incubated with M2 antibody (image top and 1744 antibody (image bottom, separately. E, F: Inhibition rate of DAPT and RO4929097 when using mouse N100 as substrates RO4929097约为410 nmol·L1 (图2B和2C。为观察以人源N100或鼠源N100作底物在此模型上是否存在差异, 以同样的方法测试了

27、鼠源N100 (图2D。得到的IC50分别为, DAPT 0.68 mol·L1及RO4929097 64 nmol·L1 (图2E和2F。3 细胞水平的N100剪切模型相对于体外实验, 细胞内的环境更加复杂, 体外模型中筛选得到的调控剂在细胞内有可能失去效果, 因此又构建了细胞水平的基于内源分泌酶的筛选模型。将来源于酵母的转录激活因子Gal4的DNA 结合序列与来源于单纯疱疹病毒的转录激活序列VP16融合表达于N100的C末端, 即构成N100-GV。当N100被分泌酶在细胞膜上剪切后, GV即跟随被剪切下的NICD离开细胞膜, 进入细胞核, 激活靶基因荧光素酶的表达。因

28、此, 荧光素酶的表达量与分泌酶剪切N100-GV活性呈直接关联关系。所以, 可利用荧光素酶作为报告基因来测试不同调控剂对内源分泌酶剪切Notch活力的影响。本文所选用的5个浓度的DAPT均能很好地抑制内源性分泌酶剪切N100的活力, 且抑制效果呈剂量依赖性, 最低浓度500 nmol·L1可抑制43%的酶活力, 最高浓度20 mol·L1可抑制70%, IC50为1.3 mol·L1 (图3A。而对于抑制剂RO4929097, 当浓度为5 nmol·L1时呈现激活效应, 激活约30%的酶活力, 这种现象在其他抑制剂中也时有发生。RO4929097对分泌酶

29、活力的影响也呈剂量依赖性, 最高浓度为500 nmol·L1时抑制约51%的酶活力, IC50约为360 nmol·L1 (图3B。实验中, 仅转pGL4.31 luc2p/ GAL4UAS/Hygro质粒或转pCDNA4/TO空质粒的两个对照组没有荧光素酶活力, 且此筛选模型所产生的活力可被已知分泌酶抑制剂剂量依赖性地抑制, 提示此筛选模型检测的信号与分泌酶剪切N100-GV 直接相关且是特异的。讨论本文首次克隆并表达纯化了来自于人源Notch1的可被分泌酶剪切的片段N100, 并以之为底物分别构建了基于分泌酶纯酶的体外剪切模型和基于细胞的分泌酶的荧光素酶报告系统筛选模型

30、。在体外剪切模型中, 作者发现人源N100可以有效地作为分泌酶底物, 且分泌酶剪切N100的活力可受调控。对已知分泌酶抑制剂DAPT的IC50约为1 mol·L1, RO4929097约为410 nmol·L1。而用该模钮 琦等: Notch 信号通路体外和细胞的药物筛选模型的建立和研究· 841 · Figure 3 Validation of cell based model with known -secretase inhibitors at different concentrations. Inhibition rate is calcula

31、ted from luminescence; error bars for standard deviation (STDEV. n = 3. A: Inhibition rate of DAPT; B: Inhibition rate of RO4929097型测试鼠源N100底物, 得到的DAPT 的IC 50值 (0.68 mol·L 1 与文献报道的鼠源Notch 剪切模型中0.110 mol·L 1 10, 17的IC 50相近 (RO4929097的IC 50未见报道, 说明模型是可靠的。同时, 与人源N100作底物的结果相比较, 发现人源N100对抑制剂DAP

32、T 的敏感程度与鼠源接近, 而对RO4929097的敏感度则低于鼠源。这一差别可能由于鼠源与人源Notch 略有不同, 使RO4929097类型的抑制剂更好地抑制鼠源Notch 的剪切。因此, 作者构建的以人源N100作底物的体外模型可以进行分泌酶抑制剂的筛选, 可为人源Notch 通路抑制剂的发现和评价提供更直接的方法。本文构建的细胞水平筛选模型, 能够检测到荧光素酶与分泌酶的活力呈正相关关系, 且能被分泌酶抑制剂呈剂量依赖地抑制, 说明此筛选模型能稳定的运作。以往文献报道的以鼠源Notch 为底物的类似模型主要应用于机制研究, 而没有成功使用此模型进行药物筛选, 因此没有对此类模型进行分泌

33、酶抑制剂的剂量依赖性的测试。作者新构建的荧光素酶报告系统模型已被证实可用于分泌酶调控剂的筛选, 且对已知的分泌酶抑制剂DAPT 的IC 50为1.3 mol·L 1, 这与体外测试得到的DAPT 的IC 50基本相当, 也与文献报道的值 (0.110 mol·L 1 类似, 说明此模型可以正确反映细胞内分泌酶剪切Notch 的情况。因此, 本文构建的基于人源底物的体外和细胞筛选模型均可用于Notch 信号通路调控剂的寻找, 且将比以往基于鼠源底物的模型更加可靠。由于分泌酶存在多种底物, 基于分泌酶构建的筛选模型筛选出的抑制剂往往存在同时抑制多个底物 (Notch 、阿尔茨海

34、默症相关蛋白APP 等 剪切而带来的副作用。因此, 无此副作用的药物往往更受欢迎18。若将本文构建的细胞水平模型与以APP-C99作底物的筛选模型同时使用, 就可以筛选出特异的调控APP 通路或Notch 通路的调控剂, 从而避免副作用的产生。近期报道的一种采用均相酶联免疫分析技术 (AlphaLISA 建立的特异性针对鼠源Notch1的分泌酶抑制剂筛选方法在通量上非常有优势, 可用1536孔板进行筛选, 但其操作步骤繁杂、昂贵, 且需要protein-A 和biotin 偶联的介质19。本文构建的体外和细胞筛选模型, 分别采用Western blotting 检测方法和荧光素酶报告系统, 虽

35、然在通量和筛选速度上不如上述方法, 但其操作简单且相对便宜, 适合大多数生物医学实验的应用。综上所述, 本文构建了一种以人源Notch 为底物的分泌酶体外和细胞的药物筛选模型, 此模型能可靠、方便、灵敏地检测分泌酶的活力, 可用于发现分泌酶的Notch 信号通路调控剂, 具有普遍和广泛的应用性。References1Lai EC. Keeping a good pathway down: transcriptional repression of Notch pathway target genes by CSL proteins J. EMBO Reports, 2002, 3: 84084

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