川贝母栽培品瓦布贝母与松贝母的总生物碱对比研究

1、 川贝母栽培品瓦布贝母与松贝母 的 总 生 物碱 对 比 研究张 培培周 勤 梅秦 波姚 志 昂彭 成郭力(成都 中医药 大 学 , 中药 资 源 系 统 研究 与 开 发 利 用 国 家 重 点 实 验 室 , 四 川 成都 610075摘要 :目的 :建立 瓦布贝母 与 松贝母 的 总 生 物 碱 定 量比 较研究 方法 。 方法 :以 贝母 素甲为 对 照 品 ,采 用 酸 性 染 料比 色 法 对 瓦布贝母 的 栽 培 品 、 野 生 品 和 松贝 中 总 生 物 碱 进行 定 量比 较研究 。 结果 :含 量 测 定结 果 显 示 , 瓦布贝母栽 培 品 中 总 生 物 碱 含 量

2、最 高 , 野 生 品 次 之 , 松贝 中 总 生 物 碱 含 量 相 对较 少 。 结 论 :为 瓦布贝母栽 培 品 作 为 扩 大 贝母类珍贵 中 药 材的 药 用 资 源 提 供 科 学 依据 。关键词 :瓦布贝母 ; 酸 性 染 料比 色 法 ; 总 生 物 碱 中图分类号 :R284. 1文献标识码 :A文章编号 :1004-0668(2011 01-0070-03基金项目 :国 家科技 支撑 计划 项 目 (编号 :2009BA184B04,生 硕 ; 作 , , 1964生 授 , 研究 方 :中 效 物 Comparative Study of Fritillaria Wab

3、uensis and Fritillariasungbei Hsiao et K . C . HsiaZHANG Pei-pei , ZHOU Qing-mei , QING Bo , et al(Chengdu University of TCM , State Key Laboratory of Systematic research , development and utilization of Chinese Medicine Resources , Chengdu 610075Abstract Objective :To establish the qualitative iden

4、tification and quantitative comparative research method of Fritillaria wa-buensis and F . sungbei Hsiao et K. C. Hsia. Method :As reference with peimine , to quantitativly comparative study on the total Alka-loids of the cultivated and wild Fritillaria wabuensis , F . sungbei Hsiao et K. C. Hsia wit

5、h acid dye colorimetry. Result :Assay results showed that the cultivated Fritillaria wabuensis has the highest total alkaloid content , followed by the wild product , the total alkaloid content of F. sungbei is relatively small. Conclusion :To provide the scientific evidences for the cultivated Frit

6、illaria wabuensis expan-ding the medical resources for the valuable Fritillaria class medicines.Key words :Fritillaria wabuensis ; acid dye colorimetry ; aldaloids瓦 布 贝 母 Fritillaria unibracteata Hsiao et K. C. Hsia var. wabuensis (S. Y. Tang et S. C. Yue Z. D. Liu , S. Wang et S. C. Chen , 习 称 为 “

7、栽 培 品 ” 1, 为 中 国 药 典 (2010年 版 一部 新 增 收 种 。 松贝母 Fritillaria sungbei Hsiao et K. C. Hsia 是 有 代 表 性的 川产 道 地 中药 材 之一 , 性 苦 、 甘 , 微 寒 。 归 肺 、 心 经 。 用 于 肺 热 燥 咳 , 干 咳 少 痰 , 阴 虚劳 嗽 , 咯痰 带 血 1, 是 临床 上 常 用 的 一 味 中药 材 , 为 贝母 类 药 材 中 质量 最 优品 。 随 着 临床 使 用 的 日益 广泛 , 贝母 类 药 材 资 源 日 渐 匮 乏 , 为 了扩 大 药 用 资 源, 中 国 药 典

8、 (2010年 版 一部 新 增 收 了 瓦布 贝母栽培品 种 。 而 目 前 关 于 瓦布贝母 2定 性 定 量 的 相 关 资料 研究 较 少 , 故我们 对 瓦布贝母 的 栽培 品 、 野 生 品与松贝 进行 对 比 研究 。 有 关 西 贝母碱 和 贝母 类 生 物碱 的 粗 提物 的 止 咳 活性 在 体 内 外 模 型中 都得 到 了 广泛 的研究 , 其 中 西 贝母碱 是作用最 强 的贝母 类 生 物碱 3, 贝母 素 甲 对对气 管 M 受 体的 拮抗 作用 4, 并且 预 实 验 发 现 , 贝母 素 甲 在 瓦布贝母 的 野 生 品与栽培品 中 含量 较 高 , 在 薄

9、层 色 谱 5-6上表 现 出 斑 点 颜 色 清 晰 , 另 有 中 国 药 典 (2010年 版 一部 中 “ 小 儿 宝 泰 康 颗粒 ” 7以 贝母 素 甲 为 对 照品 , 采 用 酸 性 染 料 比 色 法 测 定 总 生 物碱 的 含量 以 控 制 成 品 颗粒 的 质量 , 因 此 本 试 验 以 贝母 素 甲 作为 对 照品 , 酸 性 染 料 比 色 法 8-11对 其 中的 总 生 物碱 含量 进行 比 较 测 定 , 以明确 瓦布贝母 的 栽培品 、 野 生 品与松贝 之 间 的 差异 , 为临床 使 用 新 来 源 贝母 药第 1期 张 培培 等 川 贝母栽培品瓦布贝

10、母与松贝母 的 总 生 物 碱 对 比 研究材提 供 科 学 理 论 依据 , 保 证药 材质量 , 促 进 资 源 的 合 理 利 用 , 同 时 也 为药 典 增 收 瓦布贝母 的 栽培品提 供 一 定 的 科 学 支 撑 。1实验 材 料1. 1仪器紫外 可 见 分 光光 度 计 :UV 1100(上 海 天 美 科 学 仪 器 有 限 公 司 ; Sartorius 系 列 电 子 分 析 天 平 (瑞 士 ; RE-52AA 旋 转 蒸 发 器 (上 海 亚 荣 生 化 仪 器 厂 ; SHB- 循环 水 式 多用 真 空 泵 (郑 州 长 城 科 工 贸 有 限公 司 等 。 试

11、验 用 水 为纯化 水 , 其 余 试 剂 均 为 分 析纯 。1. 2试 药贝母 素 甲 对 照品 (购 自 中 国 药 品 生 物 制 品 检 定 所 , 批 号 :110750-200609, 供 含量 测 定用 ; 松 贝母 Fritillaria cirrhosa D. Don (批 号 :1010618和 1010724 、 瓦布贝母 Fritillaria unibracteata Hsiao et K. C. Hsia var. wabuensis (S. Y. Tang et S. C. Yue Z. D. Liu , S. Wang et S. C. Chen (批 号 :

12、1010610和 1010626 采 购 于 四 川 新 荷 花 中药 饮 片 股份 有 限 公 司 , 并 由 四 川 大 学 华 西 药 学 院 王 曙 教授 鉴 定 。 1. 3试 剂溴 甲 酚 绿 溶 液 :精 密 称 取 溴 甲 酚 绿 0. 0534g 与 邻 苯 二 甲 苯 酸 氢 钾 1. 0271g , 加 入 0. 2mol /L NaOH 6mL 使 溶 解 , 再 加 水 稀 释 至 100mL , 摇 匀 即 得 。2实验 方法与结果2. 1酸 性 染 料比 色 法 -紫 外 可 见 分 光光 度 法 测 定 总 生 物 碱2. 1. 1对 照品 溶 液 的 制 备精

13、 密 称 取贝母 素 甲 对 照品 7. 45mg 置 25mL 容 量 瓶 中 , 加 0. 1mol /L盐酸 溶 液 5mL 和 水 2mL 使 溶 解 , 加 水 稀 释 至 刻 度 , 摇 匀 , 即 得 浓 度 为 298g /mL的 对 照品 贮 备溶 液 , 备 用 。2. 1. 2供 试 品 溶 液 的 制 备分 别 称 取瓦布贝母 野 生 品 、 栽培品 和 松贝母 粗 粉 15g , 用 16倍 量 75%乙 醇 按渗 漉 法 提取 , 浸 润 20h , 开 始 渗 漉 , 控 制 每 sec 1滴 的 速 度 渗 漉 , 收 集 渗 漉 液 , 回 收 乙 醇 , 药

14、 液 于 60 减 压 浓 缩 , 后 定 容 至 250mL 容 量 瓶 , 备 用 。从 上 述 定 容 的 样 品 溶 液 中 分 别 精 密 移 取 50 mL , 置 小 烧 杯 中 水 浴 挥 干 乙 醇 , 加 0. 1mol /L盐酸 溶 液 20mL , 超 声 溶 解 , 后 用 浓 氨 试 液 调 节 pH 值 为 10以 上 , 加 乙 醚 振 摇 提取 5次 (30、 30、 20、 20、 20 mL , 合 并 乙 醚 液 , 蒸 干 , 残 渣 加 0. 1mol /L盐酸 5 mL 和 水 2mL , 搅 拌 溶 解 , 转 移 定 容 至 10mL 容 量

15、瓶 中 , 加 水 至 刻 度 , 摇 匀 , 滤过 , 取 续滤液 , 备 用 。 2. 1. 3线 性 关 系 考 察0. 、 0. 2、 、 0. 89, 别 分 液 漏 斗 中 , 加 水 1. 9、 1. 8、 1. 7、 1. 5、 1. 3、 1. 2、 1. 1mL , 分 别 加 溴 甲 酚 绿 溶 液 2mL , 精 密 加 氯 仿 10mL , 密 塞 , 剧 烈 振 摇 5min , 静 置 20min , 氯 仿 层 经 干滤 纸 过滤 , 续滤液 作 为 绘 制 标 准 曲 线 的 测 试 液 。 另 精 密 量取 水 2mL , 以 同 法 操 作 所 得 氯 仿

16、溶 液 为 空 白 , 取 第 4份 测 试 液在 350nm 550 nm 波 长 之 间 扫 描 , 确定最 大 吸 收 波 长 为 412nm , 在 该 波 长 处 测 定 各 溶 液 吸 收 度 , 以 吸 收 度 为 纵 坐 标 , 浓 度 为 横 坐 标 , 进行 线 性 回 归 , 得 回 归 方 程 Y =0. 0082X 0. 0406, 相 关 系数 r 2=0. 9977, 结 果 表 明 贝母 素 甲 在 14. 9g /mL 134. 1g /mL范 围 内 线 性 关 系 良好 。2. 1. 4精 密 度 试 验分 别 精 密 吸 取 298g /mL的 贝母 素

17、 甲 对 照品 溶 液 0. 5mL , 按 照 “ 2. 1. 3” 项 下 标 准 曲 线 制 备 方 法 进行 操 作 , 重 复 测 定 6次 , 测 定 吸 收 度 值 分 别 为 0. 600、 0. 598、 0. 566、 0. 593、 0. 609、 0. 594, 计 算 RSD 为 1. 45%。2. 1. 5稳 定 性 试 验将 精 密 度 试 验 所 用 的 对 照品 溶 液 , 分 别 于 显 色 后 20、 30、 40、 60、 80min 后 , 测 定 吸 收 度 值 , 计 算 相 对 标 准 偏 差 , RSD 为 1. 39%, 表 明 对 照品 溶

18、 液在 80min 之 内基 本 稳 定 。2. 1. 6加 样 回 收 率 试 验分 别 精 密移 取瓦布贝母栽培品 渗 漉 50mL , 共 9份 , 分 别 精 密 加 入 一 定 量 的 贝母 素 甲 对 照品 溶 液 , 按 “ 2. 1. 2” 项 下 方法 操 作 , 分 别 精 密移 取 0. 5mL 按 照 “ 2. 1. 3” 项 下 方法 制 备 供 试 品 溶 液 , 将 测 得 的 吸 收 度 值 进行 计 算 , 计 算 回 收 率 , 结 果 见 表 1。 表 1总生 物碱加样回 收 率 测 定结果编 号样品 中 贝母素 甲 的 量(g 加 入 的 贝母素 甲 的

19、 量(g 测 得 的 贝母素 甲 的 量(g 回 收 率(%平 均回收 率 (%RSD (%1256. 8149398. 298. 12256. 8149387. 995. 63256. 8149386. 595. 24256. 8298539. 897. 35256. 8298542. 697. 897. 21. 79 6256. 8298537. 496. 97256. 8447685. 197. 38256. 8447690. 398. 19256. 8447693. 798. 62. 1. 7重 复 性 试 验 及样品 的 测 定取样品 5批 , 按 照 “ 2. 2. 2” 和 “

20、2. 2. 3” 项 下 样 品 处理 方法 制 备 供 试 品 溶 液 , 于 412nm 处 测 定 吸 收 度 并 按 回 归 方 程 计 算 贝母 素 甲 的 含量 , 结 果 见 表 2。 3结果3. 1从 含量 测 定 结 果 可 知 , 瓦布贝母栽培品 中 总 ,中17成都中医药大学学报 2011年第 34卷物碱含量 中 总 生 物碱 的 含量 约 为 其 野 生 品 的 2倍 ,为 松贝 的 3. 5倍 。 显 示 瓦布贝母栽培品 作 为 扩 大 贝母 类 药 材 资 源具 有 较 大 的 生 物碱含量优 势 。表 2样品 中 总生 物碱 含量 测 定结果样品 名称 份 数平

21、均 含量(%, g /gRSD (%瓦布贝母栽培品 (1010610 30. 17121. 58瓦布贝母栽培品 (1010626 30. 16051. 65瓦布贝母 野 生 品 (1010610 30. 07592. 82瓦布贝母 野 生 品 (1010626 30. 07621. 73松贝母 (1010618 30. 04901. 49松贝母 (1010724 30. 04351. 373. 2以 贝母 素 甲 为 对 照品 , 采 用 酸 性 染 料 比 色 法 测 定 贝母 中 总 生 物碱 的 含量 , 操 作 简 便 , 所 用 仪 器 设 备 相 对 简 单 , 结 果 准 确 可

22、 靠 , 可 用 于 贝母 类 药 材 中 总 生 物碱 的 含量 测 定 , 为 川贝母栽培品瓦布贝母 的 质 量 控 制 提 供 参 考 。 有 研 究 者 曾 采 用 HPLC-ELSD 同 时 测 定 前 述 两 种 贝母 中 , 贝母 素 甲 和 贝母 素 乙 的 含量 , 其 中 瓦布贝母栽培品贝母 素 甲 较 高 , 达 到 总 生 物碱 的 52. 6%, 野 生 品 中 贝母 素 甲 达 到 总 生 物碱 的 28. 6%14, 相 对 于 总 生 物碱 中的 其 他 类 单体 生 物碱 较 高 , 因 此 , 以 其 为 对 照品 测 定 总 生 物碱 的 含量 具 有 较

23、 大 参 考 价 值 , 进 一 步 研究 将分 别 以 贝母 素 甲 和 西 贝碱 为 对 照品 , 对 同一 批 贝母 药 材 进行 总 生 物碱 测 定 , 比 较 测 定 结 果 。4讨 论4. 1 中 国 药 典 (2010年 版 一部 “ 川贝母 ” 项 下 测 定 总 生 物 碱 的 方 法 :以 三 氯 甲 烷 -甲 醇 (4 1 混 合 溶 液 作 为 提取 溶 媒 , 对 药 材 进行 回 流 提取 。 本 实 验中的 乙 醇 渗 漉 处理 贝母 药 材 , 为 实 验 人 员 在 灾 区 药 材 资 源 恢 复 重 建 与 综合 开 发 利 用 研究 及 示 范 指 导

24、下 , 以 贝母 类 药 材 为 原 料 的 成 方 制 剂 为 中 心 , 通 过 相 关 实 验研究 12比 较 筛 选 得 到 的 最 佳 提 取工艺 条 件 。 总 生 物碱 测 定 结 果 表 明 , 乙 醇 渗 漉 提 取贝母 类 药 材 的方法 是 可 行 的 , 与 文 献 资料 13其 他 提取 方法 所 测 得 的 结 果 基 本 一 致 , 同 时 也 为 含 有 贝 母 类 药 材 的 成 方 制 剂 的 提取 方法 和 含量 测 定 提 供 参 考 。4. 2酸 性 染 料 比 色 法 测 定 总 生 物碱 的 含量 受 到 多 种 因 素的 影响 , 在 往 样品

25、溶 液 中加 入 2mL 溴 甲 酚 绿 溶 液 之 后 , 要 充 分 振 摇 , 并 静 置 几 分 钟 , 有 利 于 生 物碱所 形 成 的 阳 离 子 与 溴 甲 酚 绿 解 离 成 的 阴 离 子 充 分 定 量 地 结 合 成 有 机 的 络 合 物 (离 子 对 。 加 入 氯 仿 之 后 , 应 剧 烈 长 时 间 振 摇 , 以 使 氯 仿 对 离 子 对 的 完 全 萃 取 , 氯 仿 层 最 后 应用 干燥滤 纸 过滤 , 整 个 萃 取 操 作 过 程 中 应保 持干燥 无水 , 以 免 水 分 的 混 入 会 带 入 没 络 合 完 全 的 溴 甲 酚 绿 , 影响

26、 比 色 , 从 而 影 响 测 定 结 果 。 此 种 测 定 总 生 物 碱 的 方 法 相 较 于 14-15来 说 , 所 较 , 果 也 相 对 准 确 。4. 3含量 测 定 结 果 表 明 松贝 中 生 物碱含量 相 对 较 低 , 提 示 着 松贝 作 为 贝母 类 药 材 中的 止 咳 佳 品 , 其 发 挥 药效 特 色 的 不 仅 是 生 物碱 类成 分 。 在 实 验 过 程 中 还进行 了 生 物碱 成 分 、 皂 苷 类成 分 及 氨 基 酸 的 薄 层鉴 别 研究 , 结 果 显 示 这 三种 不同 贝母 中 除 了 含 有 主要 成 分 生 物碱 外 , 还 含

27、 有一 些 皂 苷 类成 分 , 而 氨 基 酸含量 甚微 。 因 此下一 步 需 要 尽 可 能 收集更 多 来 源 的 贝母 , 进行 生 物碱 类成 分 和 皂 苷 类成 分 的 薄 层 色 谱 和 含量 测 定 等 相 关 系 统 的研究 , 为 不同 来 源 贝 母 的 全 面 质量 控 制 及 资 源 合 理 开 发 利 用 提 供 参 考 。 参考文献1国 家 药 典 委 员 会 . 中 国 药 典 . 2010年 版 一部 S . 中 国 医药 科技 出 版社 , 2010:34.2杜 建 红 , 王 艳 丽 , 姜 玉 , 等 . 瓦布贝母 的 生 物碱 成 分分 析 J .

28、 解 放 军 药 学学 报 , 2002, 18(1 :29-30, 33. 3Shun-Wan Chan , 等 . 高 效 液 相 色 谱 -蒸 发 光 散 射 检测 测 定 川贝母 中主要 镇 咳 生 物 活性 成 分 西 贝母碱及 其 在 鼠 体 内 药 代 动力 学 研究 J . 国 外 分 析 仪 器 , 2001 (4 :47-48.4周 颖 , 季 晖 , 李 萍 , 等 . 五 种 贝母 甾 体 生 物碱 对 豚 鼠 离 体 气 管 条 M 受 体的 拮抗 作用 J . 中 国 药 科 大 学 学 报 , 2003, 34(1 :58-60.5吴 晓 民 , 王 艳 红 , 郑 友 兰 . 平 贝母 药 材 的 薄 层 色 谱 鉴 别 J . 人 参研究 , 2