黄芪对培养心肌细胞过氧化氢损伤的保护作用

1、黄芪对培养心肌细胞过氧化氢损伤的保护作用        【关键词】 过氧化氢 【Abstract】 AIM: To investigate the protective effects of Astragalus (AS) on cardiomyocytes against hydrogen peroxide (H2O2)induced injury. METHODS: Cultured neonatal cardiomyocytes were divided into three groups: No 

2、           【关键词】  过氧化氢 【Abstract】 AIM:   To investigate the protective effects of Astragalus (AS) on cardiomyocytes against hydrogen peroxide (H2O2)induced injury. METHODS:  Cultured neonatal cardiomyocytes were divided into

3、three groups:  Normal group; H2O2 group, in which cells were treated with H2O2（0.2 mmol/L） for 1 h; AS+ H2O2 group, in which cells were pretreated with AS（with final concentration of 200 mg/mL）30 min before H2O2 treatment. Colorimetric assay was used to detect the mitochondrion activity, lactat

4、e dehydrogenase (LDH) activity, superoxide dismutase (SOD) activity and malonaldehyde (MDA) content. RESULTS:  After treatment with H2O2, the mitochondrion activity was significantly reduced to 0.36±0.04 compared with that of normal group while the LDH activity was （27.4±3.2）kat/L, si

5、gnificantly higher than that of normal group. SA pretreatment markedly increased the mitochondrion activity to 0.50±0.05 and reduced LDH activity to （16.4±1.8）kat/L. Cells treated with H2O2 had a lower SOD activity of （231±22） kat/L and a higher MDA content of（16.1±3.0）mol/L comp

6、ared with those of normal cells. Cells of SA+H2O2 group had a higher SOD activity of （331±40）kat/L and a lower MDA content of （10.7±2.4）mol/L compared with those of H2O2 group. CONCLUSION:  SA can protect cardiomyocytes from H2O2 injury by improving cell antioxidant ability. 【Keywords

7、】  Astragalus membranaceus, myocardium/cytology; hydrogen peroxide 【摘要】 目的： 探讨中药黄芪（Astragalus， AS）对培养的心肌细胞氧化性损伤的保护作用及其机制. 方法： 体外培养的新生大鼠心肌细胞，分为3组： 对照组（Normal组）； H2O2组： H2O2 （0.2 mmol/L）与心肌细胞共育1 h； 黄芪+H2O2组： 黄芪处理心肌细胞30 min后，加入H2O2与心肌细胞共育1 h. 心肌细胞损伤以细胞线粒体活性和乳酸脱氢酶（LDH）活性来表示，同时检测心肌细胞超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙

8、二醛（MDA）含量，均以比色法检测. 结果： H2O2处理细胞后可使细胞LDH活性显著增高（27±3） kat/L，细胞线粒体活性明显下降0.36±0.04，SOD 活性较正常细胞显著下降（231±22）kat/L，MDA含量显著增高（16±3）mol/L. 黄芪处理细胞后可显著提高心肌细胞线粒体活性0.50±0.05，降低LDH活性（16.4±1.8） kat/L；并提高细胞抗氧化能力，表现为较H2O2处理组，SOD活性增高（331±40） kat/L，MDA含量下降（10.7±2.4）mol/L. 结论： 黄芪

9、可对抗H2O2对心肌细胞的损伤，其机制与提高心肌细胞抗氧化损伤能力有关.   【关键词】 黄芪；心肌/细胞学；过氧化氢 0引言 黄芪（Astragalus，AS）自古以来就被神农本草经列为上品，它含有多糖、甙、黄酮和微量元素等多种成分，近来的研究表明黄芪对肾病、心脑血管疾病和免疫系统疾病均有较好的疗效，尤其广泛用于心肌缺血时的辅助治疗，但其作用机制尚不明确. 心肌缺血再灌注是治疗缺血性心脏时不可避免的损伤，其中氧化自由基损伤是一个主要的原因. 本实验中我们以体外培养的大鼠乳鼠心肌细胞为基础，以过氧化氢造成氧化自由基损伤模型1，观察黄芪处理细胞后对H2O2损伤的抵抗作用. 1材料和方法

10、 11材料 13 d龄新生SD大鼠仔鼠购于第四军医大学实验动物中心. 四甲基偶氮唑蓝（MTT）购于Sigma公司. 黄芪注射液（2 g/mL， 970806）购于上海福达制药有限公司. 胎牛血清、高糖Dulbecco 最低必需培养液（DMEM）购于Hyclone公司. LDH, SOD, MDA检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所. 12方法 1.2.1心肌细胞培养取13 d SD仔鼠，在其剑突下剪开十字切口，取下心脏，磷酸缓冲液（PBS）冲洗后，将心肌组织剪碎经1 g/L胶原酶消化，收集消化后的悬液，加入少量含100 mL/L胎牛血清（FCS）的高糖DMEM，1000 r /min离心5 m

11、in，弃去上清，以高糖DMEM悬浮，接种于10 cm培养皿中，用差速贴壁法于37, 50 mL /L CO2孵箱中培养45 min. 将培养液离心，再次接种于含100 mL/L胎牛血清的DMEM中，细胞密度约为5×105/L. 24 h后，换为不含血清的高糖DMEM培养液. 取生长72 h的心肌细胞进行实验研究.   1.2.2实验分组心肌细胞分别接种于24孔板和96孔板，每组6孔. 实验分为： 正常对照组（Normal组）：心肌细胞不做任何处理； H2O2组： H2O2（0.2 mmol/L）与心肌细胞共育1 h； 黄芪+H2O2组： 心肌细胞加入终浓度为200 g/L的

12、黄芪注射液孵育30 min，再加入H2O2孵育1 h. 1.2.3检测指标 心肌细胞形态学变化： 在倒置显微镜下观察细胞生长状态、细胞形状及收缩性. MTT比色法检测心肌细胞线粒体活性： 与实验孔平行设不加细胞只加培养液的空白对照孔，比色时以空白孔调零. 心肌细胞线粒体活性以570 nm处（A）值表示. 心肌细胞培养上清LDH（乳酸脱氢酶）活性检测： 取细胞培养上清50 L，按照试剂盒说明操作，反应后440 nm处测各管吸光度A值. 心肌细胞培养上清SOD（超氧化物歧化酶）活性和MDA（丙二醛）含量检测： SOD活力测定采用黄嘌呤氧化酶法；MDA测定采用硫代巴比妥酸比色法. 取心肌细胞培养上清

13、50 L，按照试剂盒说明进行.统计学处理： 所有数据均以x±s表示，应用非参数秩和检验法进行组间比较，P<0.05表示两组差别具有显著性的意义. 2结果 21心肌细胞形态学改变倒置显微镜下观察正常心肌细胞生长融合成片状，有规律搏动. 而H2O2组心肌细胞部分细胞皱缩，搏动减慢，幅度减弱，并且不规则. 黄芪注射液+H2O2组心肌细胞在细胞形状、搏动方面与正常组心肌细胞无明显差别. 22心肌细胞线粒体活性和LDH活性H2O2处理心肌细胞后其线粒体活性较正常心肌细胞下降，但其培养上清LDH活性显著增高（P<0.01）；黄芪注射液+H2O2组心肌细胞线粒体活性较H2O2组显著增高

14、（P<0.01），而LDH活性较H2O2组明显降低（P<0.01， Tab 1）.表1AS对心肌细胞线粒体活性、LDH活性的影响（略）     23心肌细胞SOD和MDA活性H2O2处理心肌细胞后其SOD活性较正常心肌细胞下降，但其MDA活性显著增高（P0.01）；黄芪注射液+H2O2组心肌细胞，其SOD活性较H2O2组显著增高（P0.01），而MDA活性较H2O2组明显降低（P0.05，            23心肌细胞

15、SOD和MDA活性H2O2处理心肌细胞后其SOD活性较正常心肌细胞下降，但其MDA活性显著增高（P<0.01）；黄芪注射液+H2O2组心肌细胞，其SOD活性较H2O2组显著增高（P<0.01），而MDA活性较H2O2组明显降低（P<0.05， Tab 2）.表2AS对心肌细胞SOD和MDA活性的影响（略） 3讨论 过氧化自由基对心肌细胞的损伤已越来越引起人们的重视. 心肌缺血再灌注损伤是心血管内外科常见的而又不可避免的心肌损伤，目前尚无有效的防治措施，而心肌缺血再灌注时氧自由基损伤起了主要作用2. 心肌细胞缺氧时，ATP生成减少，分解增多，导致ADP、AMP增加，后者降解为次

16、黄嘌呤，而次黄嘌呤正是产生氧自由基（oxygen derived free radical，ODFR）的底物. 在氧供不足时，黄嘌呤脱氢酶可在钙依赖蛋白酶的作用下迅速转化为黄嘌呤氧化酶. 因此细胞已具备了产生ODFR的底物（次黄嘌呤）和催化底物产生ODFR的酶（黄嘌呤氧化酶），为氧自由基的产生准备好了条件，一旦细胞通过复氧或再灌注得到氧供，就会触发和促进ODFR的生成. 氧自由基具有强烈引发脂质过氧化作用，可引发链式脂质过氧化反应，它们几乎可以同任何细胞成份发生反应，从而达到损伤细胞的目的. 因此，ODFR具有相当高的生物毒性. 在正常情况下有少量ODFR生成并无关大局，因为细胞内存在有SOD

17、3，过氧化氢酶（catalase， CAT），以及谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase， GSHps），这些酶能及时将体内过剩的ODFR还原成水而被清除. 但是当ODFR的产生量超过了其清除能力时就会引发自由基损伤4. 因此，如何提高心肌细胞抗氧化自由基损伤能力是防治心肌缺血再灌注损伤的关键. 实验中观察到H2O2处理细胞后，LDH活性明显升高，心肌细胞线粒体活性显著降低，表明H2O2有显著的心肌细胞毒性作用. 而预先给予黄芪注射液则可显著减轻H2O2对心肌细胞的损伤作用. 同时观察到H2O2处理细胞后MDA活性增高，而SOD活性下降，表明心肌细胞抗氧化自由基损伤能

18、力下降，细胞发生了氧自由基损伤，而黄芪注射液可显著降低心肌细胞MDA含量，升高SOD活性，而提高心肌细胞抗氧化损伤能力. 综上所述，黄芪注射液可以通过提高心肌细胞抗氧化损伤能力，而对抗H2O2活性氧自由基对心肌细胞的损伤作用. 为临床上应用黄芪注射液辅助治疗缺血性心脏病提供了理论依据. 【参考文献】 1  郑延松，李源，张珊红，等. 用低浓度过氧化氢建立心肌细胞氧化损伤模型J. 第四军医大学学报，2001; 22(20):1849-1851. Zheng YS, Li Y, Zhang SH, et al. Experimental model of H2O2 induced oxidative injury in cardiomyocytes J. J Fo