华科同济医学院生化蛋白质的结构与功能PPT课件

1、n什么是蛋白质? ?蛋白质(protein)是由许多氨基酸(amino acids)通过肽键(peptide bond)相连形成的高分子含氮化合物。第1页/共104页n蛋白质研究的历史18331833年，从麦芽中分离淀粉酶；随后从胃液中年，从麦芽中分离淀粉酶；随后从胃液中分离到类似胃蛋白酶的物质。分离到类似胃蛋白酶的物质。18641864年，血红蛋白被分离并结晶。年，血红蛋白被分离并结晶。1919世纪末，证明蛋白质由氨基酸组成，并合成世纪末，证明蛋白质由氨基酸组成，并合成了多种短肽。了多种短肽。2020世纪初，发现蛋白质的二级结构；完成胰岛世纪初，发现蛋白质的二级结构；完成胰岛素一级结构测定。

2、素一级结构测定。第2页/共104页2020世纪中叶，各种蛋白质分析技术相继建立，世纪中叶，各种蛋白质分析技术相继建立，促进了蛋白质研究迅速发展；促进了蛋白质研究迅速发展；19621962年，确定了血红蛋白的四级结构。年，确定了血红蛋白的四级结构。2020世纪世纪9090年代，功能基因组与蛋白质组研究地年代，功能基因组与蛋白质组研究地展开。展开。第3页/共104页n蛋白质的生物学重要性分布广：分布广：所有器官、组织都含有蛋白质；细胞的各个部分都含有蛋白所有器官、组织都含有蛋白质；细胞的各个部分都含有蛋白质。质。含量高：含量高：蛋白质是细胞内最丰富的有机分子，占人体干重的蛋白质是细胞内最丰富的有机

3、分子，占人体干重的4545，某，某些组织含量更高，例如脾、肺及横纹肌等高达些组织含量更高，例如脾、肺及横纹肌等高达8080。1. 蛋白质是生物体重要组成成分第4页/共104页作为生物催化剂（酶）作为生物催化剂（酶）代谢调节作用代谢调节作用免疫保护作用免疫保护作用物质的转运和存储物质的转运和存储运动与支持作用运动与支持作用参与细胞间信息传递参与细胞间信息传递2. 蛋白质具有重要的生物学功能3. 氧化供能第5页/共104页蛋白质的分子组成蛋白质的分子组成The Molecular Component of Protein第一节第一节第6页/共104页n组成蛋白质的元素主要有C、H、O、N和 S。

4、有些蛋白质含有少量磷或金属元素铁、铜、锌、锰、钴、钼，个别蛋白质还含有碘 。第7页/共104页 各种蛋白质的含氮量很接近，平均为各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16。 由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此，只要测定生物样品中的含氮量，就可以根据以下公式推算出蛋白质的大致含量：100克样品中蛋白质的含量克样品中蛋白质的含量 (g %)= 每克样品含氮克数每克样品含氮克数 6.251001/16%n蛋白质元素组成的特点第8页/共104页一、组成人体蛋白质的20种氨基酸均属于L- -氨基酸 存在自然界中的氨基酸有300余种，但组成人体蛋白质的氨基酸仅有20种，且均属 L-氨基酸（甘氨酸除外）。第9页

5、/共104页H甘氨酸甘氨酸CH3丙氨酸丙氨酸L-L-氨基酸的通式氨基酸的通式RC+NH3COO-H第10页/共104页非极性脂肪族氨基酸非极性脂肪族氨基酸极性中性氨基酸极性中性氨基酸芳香族氨基酸芳香族氨基酸酸性氨基酸酸性氨基酸碱性氨基酸碱性氨基酸二、氨基酸可根据侧链结构和理化性质进行分类第11页/共104页( (一一) )侧链含烃链的氨基酸属于非极性脂肪族侧链含烃链的氨基酸属于非极性脂肪族氨基酸氨基酸第12页/共104页( (二二) )侧链有极性但不带电荷的氨基酸是极性侧链有极性但不带电荷的氨基酸是极性中性氨基酸中性氨基酸第13页/共104页( (三三) )侧链含芳香基团的氨基酸是芳香族氨基酸

6、侧链含芳香基团的氨基酸是芳香族氨基酸第14页/共104页( (四四) )侧链含负性解离基团的氨基酸是酸性氨基酸侧链含负性解离基团的氨基酸是酸性氨基酸第15页/共104页( (五五) )侧链含正性解离基团的氨基酸属于碱性侧链含正性解离基团的氨基酸属于碱性氨基酸氨基酸第16页/共104页n几种特殊氨基酸 脯氨酸脯氨酸（亚氨基酸）（亚氨基酸）CH2CHCOO-NH2+CH2CH2CH2CHCOO-NH2+CH2CH2第17页/共104页 半胱氨酸半胱氨酸 +胱氨酸胱氨酸二硫键二硫键-HH-OOC-CH-CH2-S+NH3S-CH2-CH-COO-+NH3-OOC-CH-CH2-S+NH3S-CH2-

7、CH-COO-+NH3-OOC-CH-CH2-SH+NH3-OOC-CH-CH2-SH+NH3HS-CH2-CH-COO-+NH3HS-CH2-CH-COO-+NH3第18页/共104页三、20种氨基酸具有共同或特异的理化性质n两性解离及等电点两性解离及等电点氨基酸是两性电解质，其解离程度取决于所氨基酸是两性电解质，其解离程度取决于所处溶液的酸碱度。处溶液的酸碱度。等电点等电点(isoelectric point, pI) 在某一在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性。此时溶

8、液的中性。此时溶液的pH值值称为该氨基酸的称为该氨基酸的等电点等电点。（一）氨基酸具有两性解离的性质第19页/共104页pH=pI+OH-pHpI+H+OH-+H+pHpI氨基酸的兼性离子氨基酸的兼性离子 阳离子阳离子阴离子阴离子CHNH2COOHR CHNH2COOHRCHNH3+COO-R CHNH3+COO-RCHNH2COO-R CHNH2COO-RCH COOHRNH3+CH COOHRNH3+第20页/共104页（二）含共轭双键的氨基酸具有紫外吸收性质色氨酸、酪氨酸色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在的最大吸收峰在 280 nm 附近。附近。大多数蛋白质含大多数蛋白质含有这两种氨基酸残基，

9、有这两种氨基酸残基，所以测定蛋白质溶液所以测定蛋白质溶液280nm的光吸收值是分的光吸收值是分析溶液中蛋白质含量析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法。的快速简便的方法。芳香族氨基酸的紫外吸收芳香族氨基酸的紫外吸收第21页/共104页（三）氨基酸与茚三酮反应生成蓝紫色化合物氨基酸与茚三酮水合物共热，可生成氨基酸与茚三酮水合物共热，可生成蓝蓝紫色紫色化合物，其最大吸收峰在化合物，其最大吸收峰在570nm处。处。由于此吸收峰值与氨基酸的含量存在正由于此吸收峰值与氨基酸的含量存在正比关系，因此可作为氨基酸定量分析方法。比关系，因此可作为氨基酸定量分析方法。第22页/共104页四、蛋白质是由许多氨基酸残基

10、组成的多肽链肽键肽键( (peptide bond) )是由一个氨基酸的是由一个氨基酸的 - -羧基与另一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的 - -氨基脱水缩合而形成氨基脱水缩合而形成的化学键。的化学键。（一）氨基酸通过肽键连接而形成肽 (peptide)第23页/共104页NH2-CH-CHOOH甘甘氨氨酸酸NH2-CH-CHOOH甘甘氨氨酸酸NH-CH-CHOHO OH甘甘氨氨酸酸+-HOH甘氨酰甘氨酸甘氨酰甘氨酸肽键NH2-CH-C-N-CH-COOHHHHONH2-CH-C-N-CH-COOHHHHO第24页/共104页肽是由氨基酸通过肽键缩合而形成的化肽是由氨基酸通过肽键缩合而形成的化合

11、物。合物。两分子氨基酸缩合形成二肽，三分子氨基两分子氨基酸缩合形成二肽，三分子氨基酸缩合则形成三肽酸缩合则形成三肽肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被称为氨基酸残基不全，被称为氨基酸残基(residue)。由十个以内氨基酸相连而成的肽称为寡肽由十个以内氨基酸相连而成的肽称为寡肽(oligopeptide)，由更多的氨基酸相连形成的肽，由更多的氨基酸相连形成的肽称多肽称多肽(polypeptide)。第25页/共104页N 末端：多肽链中有末端：多肽链中有游离游离-氨基氨基的一端的一端C 末端：多肽链中有末端：多肽链中有游离游离-羧基羧基的一端的一端n

12、多肽链有两端：多肽链多肽链(polypeptide chain)是指许多是指许多氨基酸之间以肽键连接而成的一种结构。氨基酸之间以肽键连接而成的一种结构。第26页/共104页N末端末端C末端末端牛核糖核酸酶牛核糖核酸酶第27页/共104页（二）体内存在多种重要的生物活性肽 1. 谷胱甘肽(glutathione, GSH)第28页/共104页GSH过氧过氧化物酶化物酶H2O2 2GSH 2H2O GSSG GSH还原酶还原酶NADPH+H+ NADP+ nGSH与与GSSG间的转换间的转换 第29页/共104页 体内许多激素属寡肽或多肽体内许多激素属寡肽或多肽 神经肽神经肽(neuropepti

13、de)2.多肽类激素及神经肽多肽类激素及神经肽第30页/共104页蛋白质的分子结构蛋白质的分子结构The Molecular Structure of Protein 第二节第二节第31页/共104页n蛋白质的分子结构包括蛋白质的分子结构包括: 高级高级结构结构一级结构一级结构(primary structure)二级结构二级结构(secondary structure)三级结构三级结构(tertiary structure)四级结构四级结构(quaternary structure)第32页/共104页n定义:蛋白质的一级结构指在蛋白质分子从蛋白质的一级结构指在蛋白质分子从N-端至端至C-端

14、的端的氨基酸排列顺序氨基酸排列顺序。一、氨基酸的排列顺序决定蛋白质的一级结构n主要的化学键:肽键肽键，有些蛋白质还包括二硫键。，有些蛋白质还包括二硫键。 第33页/共104页一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能功能的基础的基础，但不是决定蛋白质空间构象的但不是决定蛋白质空间构象的唯一因素唯一因素。第34页/共104页二、二、多肽链的局部主链构象为蛋白质多肽链的局部主链构象为蛋白质二级结构二级结构蛋白质分子中某一段肽链的局部空间蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，即该段肽链主链骨架原子的相对空结构，即该段肽链主链骨架原子的相对空间位置，并不涉及氨基酸残基

15、侧链的构象间位置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象 。n定义: : n主要的化学键：氢键氢键 第35页/共104页（一）参与肽键形成的6个原子在同一平面上参与肽键的参与肽键的6个原子个原子C 1、C、O、N、H、C 2位于同一位于同一平面，平面，C 1和和C 2在平面上所处的位置为反式在平面上所处的位置为反式(trans)构型，此构型，此同一平面上的同一平面上的6个原子构成了所谓的个原子构成了所谓的肽单元肽单元 (peptide unit) 。第36页/共104页（一）参与肽键形成的6个原子在同一平面上参与肽键的参与肽键的6个原子个原子C 1、C、O、N、H、C 2位于同一位于同一平面，平面，C

16、1和和C 2在平面上所处的位置为反式在平面上所处的位置为反式(trans)构型，此构型，此同一平面上的同一平面上的6个原子构成了所谓的个原子构成了所谓的肽单元肽单元 (peptide unit) 。第37页/共104页 - -螺旋螺旋 ( -helix) - -折叠折叠 ( -pleated sheet) - -转角转角 ( -turn) 无规卷曲无规卷曲 (random coil) （二）-螺旋结构是常见的蛋白质二级结构n蛋白质二级结构第38页/共104页n - -螺旋第39页/共104页（三） - -折叠使多肽链形成片层结构第40页/共104页（四）（四） - -转角和无规卷曲在蛋白质分子

17、中转角和无规卷曲在蛋白质分子中普遍存在普遍存在 - -转角转角无规卷曲是用来阐述没有确定规律性的那部无规卷曲是用来阐述没有确定规律性的那部分肽链结构。分肽链结构。第41页/共104页（五）模体是具有特殊功能的超二级结构在许多蛋白质分子中，可发现二个或三个具在许多蛋白质分子中，可发现二个或三个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个个有规则的二级结构组合，被称为有规则的二级结构组合，被称为超二级结构超二级结构。二级结构组合形式有二级结构组合形式有3 3种：种：， 。第42页/共104页二个或三个具有二级结构的肽段，在空间二个或三个具有二级结构的肽段

18、，在空间上相互接近，形成一个特殊的空间构象，称为上相互接近，形成一个特殊的空间构象，称为模体模体(motif) 。模体是具有特殊功能的超二级结构。模体是具有特殊功能的超二级结构。第43页/共104页钙结合蛋白中结合钙结合蛋白中结合钙离子的模体钙离子的模体锌指结构锌指结构- -螺旋螺旋-转角（或转角（或环）环）-螺旋模体螺旋模体链链-转角转角- -链模体链模体链链-转角转角-螺旋螺旋-转角转角- -链模体链模体n模体常见的形式第44页/共104页（六）氨基酸残基的侧链对二级结构形成的影响蛋白质二级结构是以一级结构为基础的。蛋白质二级结构是以一级结构为基础的。一段肽链其氨基酸残基的侧链适合形成一段

19、肽链其氨基酸残基的侧链适合形成 - -螺旋螺旋或或-折叠，它就会出现相应的二级结构。折叠，它就会出现相应的二级结构。 第45页/共104页三、在二级结构基础上多肽链进一步折叠形成蛋白质三级结构疏水键、离子键、氢键和疏水键、离子键、氢键和 Van der Waals力等。力等。n主要的化学键:整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。n定义:（一）三级结构是指整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置第46页/共104页第47页/共104页 肌红蛋白肌红蛋白 (Mb) N 端端 C端端第

20、48页/共104页纤连蛋白分子的结构域纤连蛋白分子的结构域（二）结构域是三级结构层次上的局部折叠区分子量较大的蛋白质常可折叠成多个结构较为紧分子量较大的蛋白质常可折叠成多个结构较为紧密的区域，并各行其功能，称为结构域密的区域，并各行其功能，称为结构域 ( (domain) ) 。第49页/共104页（三）分子伴侣参与蛋白质折叠分子伴侣分子伴侣(chaperon)通过提供一个保护环境从而通过提供一个保护环境从而加速蛋白质折叠成天然构象或形成四级结构。加速蛋白质折叠成天然构象或形成四级结构。分子伴侣可逆地与未折叠肽段的疏水部分结合随分子伴侣可逆地与未折叠肽段的疏水部分结合随后松开，如此重复进行可防

21、止错误的聚集发生，后松开，如此重复进行可防止错误的聚集发生，使肽链正确折叠。使肽链正确折叠。 分子伴侣也可与错误聚集的肽段结合，使之解聚分子伴侣也可与错误聚集的肽段结合，使之解聚后，再诱导其正确折叠。后，再诱导其正确折叠。 分子伴侣在蛋白质分子折叠过程中二硫键的正确分子伴侣在蛋白质分子折叠过程中二硫键的正确形成起了重要的作用。形成起了重要的作用。 第50页/共104页伴侣蛋白在蛋白质折叠中的作用伴侣蛋白在蛋白质折叠中的作用第51页/共104页亚基之间的结合主要是氢键和离子键。亚基之间的结合主要是氢键和离子键。四、四、含有二条以上多肽链的蛋白质含有二条以上多肽链的蛋白质具有四级结构具有四级结构蛋

22、白质分子中各亚基的空间排布及亚基接蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，称为触部位的布局和相互作用，称为蛋白质的四级蛋白质的四级结构结构。有些蛋白质分子含有二条或多条多肽链，有些蛋白质分子含有二条或多条多肽链，每一条多肽链都有完整的三级结构，称为蛋白每一条多肽链都有完整的三级结构，称为蛋白质的质的亚基亚基 (subunit)。第52页/共104页由由2个亚基组成的蛋白质四级结构中，若亚基分子个亚基组成的蛋白质四级结构中，若亚基分子结构相同，称之为结构相同，称之为同二聚体同二聚体(homodimer)，若亚基分，若亚基分子结构不同，则称之为子结构不同，则称之为异二聚体异二聚

23、体(heterodimer)。 血红蛋白的血红蛋白的四级结构四级结构第53页/共104页五、蛋白质的分类n根据蛋白质组成成分:单纯蛋白质单纯蛋白质结合蛋白质结合蛋白质 = = 蛋白质部分蛋白质部分 + + 非蛋白质部分非蛋白质部分n根据蛋白质形状:纤维状蛋白质纤维状蛋白质球状蛋白质球状蛋白质第54页/共104页六、蛋白质组学（一）蛋白质组学基本概念蛋白质组是指一种细胞或一种生物所表蛋白质组是指一种细胞或一种生物所表达的全部蛋白质，即达的全部蛋白质，即“一种基因组所表达的一种基因组所表达的全套蛋白质全套蛋白质”。 第55页/共104页（二）蛋白质组学研究技术平台 蛋白质组学是高通量，高效率的研究

24、蛋白质组学是高通量，高效率的研究: :双向电泳分离样品蛋白质双向电泳分离样品蛋白质 蛋白质点的定位、切取蛋白质点的定位、切取 蛋白质点的质谱分析蛋白质点的质谱分析 （三）蛋白质组学研究的科学意义第56页/共104页蛋白质结构与功能的关系蛋白质结构与功能的关系The Relation of Structure and Function of Protein第三节第三节第57页/共104页（一）一级结构是空间构象的基础一、蛋白质一级结构是高级结构与功能的基础牛核糖核酸酶的牛核糖核酸酶的一级结构一级结构二二硫硫键键第58页/共104页 天然状态，天然状态，有催化活性有催化活性 尿素、尿素、 -巯基乙

25、醇巯基乙醇 去除尿素、去除尿素、-巯基乙醇巯基乙醇非折叠状态，无活性非折叠状态，无活性第59页/共104页（二）一级结构相似的蛋白质具有相似的高级结构与功能一级结构相似的多肽或蛋白质，其空间构象一级结构相似的多肽或蛋白质，其空间构象以及功能也相似。以及功能也相似。 氨基酸残基序号氨基酸残基序号胰岛素胰岛素 A5 5 A6 6 A10 10 A3030 人人 Thr Ser Ile Thr 猪猪 Thr Ser Ile Ala 狗狗 Thr Ser Ile Ala 兔兔 Thr Gly Ile Ser 牛牛 Ala Gly Val Ala 羊羊 Ala Ser Val Ala 马马 Thr Se

26、r Ile Ala第60页/共104页（三）氨基酸序列提供重要的生物化学信息一些广泛存在于生一些广泛存在于生物界的蛋白质如细胞色物界的蛋白质如细胞色素素(cytochrome C)，比，比较它们的一级结构，可较它们的一级结构，可以帮助了解物种进化间以帮助了解物种进化间的关系。的关系。 第61页/共104页（四）重要蛋白质的氨基酸序列改变可引起疾病n例：镰刀形红细胞贫血N-val his leu thr pro glu glu C(146)HbS 肽链肽链HbA 肽肽 链链N-val his leu thr pro val glu C(146) 这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，这种由蛋白质

27、分子发生变异所导致的疾病，称为称为“分子病分子病”。第62页/共104页n肌红蛋白肌红蛋白/ /血红蛋白血红蛋白含有血红素辅基含有血红素辅基血红素结构血红素结构 二、蛋白质的功能依赖特定空间结构（一）血红蛋白亚基与肌红蛋白结构相似第63页/共104页n肌红蛋白( (myoglobin，Mb) ) 肌红蛋白是一个只有三级肌红蛋白是一个只有三级结构的单链蛋白质，有结构的单链蛋白质，有8 8段段 - -螺螺旋结构。旋结构。血红素分子中的两个丙酸血红素分子中的两个丙酸侧链以离子键形式与肽链中的侧链以离子键形式与肽链中的两个碱性氨基酸侧链上的正电两个碱性氨基酸侧链上的正电荷相连，加之肽链中的荷相连，加之

28、肽链中的F8F8组氨组氨酸残基还与酸残基还与FeFe2+2+形成配位结合，形成配位结合，所以血红素辅基与蛋白质部分所以血红素辅基与蛋白质部分稳定结合。稳定结合。 第64页/共104页n血红蛋白( (hemoglobin，Hb) )血红蛋白具有血红蛋白具有4个亚个亚基组成的四级结构，基组成的四级结构，每每个亚基可结合个亚基可结合1 1个血红素个血红素并携带并携带1 1分子氧分子氧。Hb亚基之间通过亚基之间通过8对盐键，使对盐键，使4个亚基紧密个亚基紧密结合而形成亲水的球状结合而形成亲水的球状蛋白。蛋白。 第65页/共104页Hb与Mb一样能可逆地与O2结合， Hb与O2结合后称为氧合Hb。氧合H

29、b占总Hb的百分数（称百分饱和度）随O2浓度变化而改变。（二）血红蛋白亚基构象变化可影响亚基与氧结合第66页/共104页肌红蛋白肌红蛋白(Mb)和血红蛋白和血红蛋白(Hb)的氧解离曲线的氧解离曲线第67页/共104页n协同效应( (cooperativity) )一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为协同效应。 如果是促进作用则称为正协同效应 ( (positive cooperativity) )如果是抑制作用则称为负协同效应( (negative cooperativity) )第68页/共104页第69页/共104页O2血红素与氧结

30、血红素与氧结合后，铁原子半径合后，铁原子半径变小，就能进入卟变小，就能进入卟啉环的小孔中，继啉环的小孔中，继而引起肽链位置的而引起肽链位置的变动。变动。第70页/共104页n变构效应(allosteric effect)蛋白质空间结构的改变伴随其功能的变化，称为变构效应。第71页/共104页（三）蛋白质构象改变可引起疾病蛋白质构象疾病蛋白质构象疾病：若蛋白质的折叠发生：若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生。致疾病发生。第72页/共104页蛋白质构象改变

31、导致疾病的机理蛋白质构象改变导致疾病的机理：有些蛋：有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。这类疾病包括这类疾病包括：人纹状体脊髓变性病、老：人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。第73页/共104页疯牛病是由朊病毒蛋白疯牛病是由朊病毒蛋白(prion protein, PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。引起的一组人和动物神经退行性病变。正常的

32、正常的PrP富含富含-螺旋，称为螺旋，称为PrPc。PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变成全在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为为-折叠的折叠的PrPsc，从而致病。，从而致病。PrPc-螺旋螺旋PrPsc-折叠折叠正常正常疯牛病疯牛病n疯牛病中的蛋白质构象改变第74页/共104页第四节第四节蛋白质的理化性质蛋白质的理化性质The Physical and Chemical Characters of Protein第75页/共104页一、蛋白质具有两性电离的性质蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液氨基酸残基侧链中

33、某些基团，在一定的溶液pH条条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。 当蛋白质溶液处于某一当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的荷为零，此时溶液的pH称为称为蛋白质的等电点。蛋白质的等电点。n蛋白质的等电点( isoelectric point, pI)第76页/共104页二、蛋白质具有胶体性质蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万至万至100万之巨，其分子的直径可达万之巨，其分子的直径可达1100n

34、m，为胶粒范围之内。为胶粒范围之内。 颗粒表面电荷颗粒表面电荷 水化膜水化膜n蛋白质胶体稳定的因素:第77页/共104页+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜水化膜+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒不稳定的蛋白质颗粒酸酸碱碱酸酸碱碱酸酸碱碱脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质的聚沉第78页/共104页三、蛋白质空间结构破坏而引起变性在某些物理和化学因素作用下，其特定的在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无空间构象被破坏

35、，也即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失。物活性的丧失。n蛋白质的变性(denaturation)第79页/共104页n造成变性的因素造成变性的因素: :如如加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂等重金属离子及生物碱试剂等 。 n变性的本质变性的本质: :破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白质的一级结构。质的一级结构。第80页/共104页n 应用举例应用举例: :临床医学上，变性因素常被应用来消毒及临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌

36、。灭菌。此外此外, , 防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。制剂（如疫苗等）的必要条件。 第81页/共104页若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为象和功能，称为复性复性(renaturation) 。第82页/共104页 天然状态，天然状态，有催化活性有催化活性 尿素、尿素、 -巯基乙醇巯基乙醇 去除尿素、去除尿素、-巯基乙醇巯基乙醇非折叠状态，无活性非折叠状态，无活性第83页/共104页在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露

37、在外，肽在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽链融会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。链融会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。淀，但并不变性。 蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。 n蛋白质沉淀n蛋白质的凝固作用(protein coagulation)第84页/共104页四、蛋白质在紫外光谱区有特征性吸收峰由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨

38、酸，因此在和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收波长处有特征性吸收峰。蛋白质的峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。此可作蛋白质定量测定。第85页/共104页蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应。三酮反应。 蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双双缩脲反应缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。程度。五、应用蛋白质呈色反应可测定蛋白质溶液含量1.茚

39、三酮反应(ninhydrin reaction)2. 双缩脲反应(biuret reaction)第86页/共104页第五节第五节蛋白质的分离纯化与结构分析蛋白质的分离纯化与结构分析The Separation and Purification and Structure Analysis of Protein第87页/共104页一、一、透析及超滤法可去除蛋白质溶液中的透析及超滤法可去除蛋白质溶液中的小分子化合物小分子化合物应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。的目的。n透

40、析(dialysis)n超滤法利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法物分开的方法。第88页/共104页二、丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀是常用二、丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀是常用的蛋白质沉淀方法的蛋白质沉淀方法使用使用丙酮沉淀丙酮沉淀时，必须在时，必须在04低温下进行，低温下进行，丙酮用量一般丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外，被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。也可用乙醇沉淀。 盐析盐析(salt precipitation)是将硫酸铵、硫酸钠是将硫酸铵、硫酸钠或

41、氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。 第89页/共104页免疫沉淀法：免疫沉淀法：将某一纯化蛋白质免疫动物可获得将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。 第90页/共104页三、利用荷电性质可用电泳法将蛋白质分离蛋白质在高于或低于其蛋白质在高于或低

42、于其pIpI的溶液中为带电的的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术术, , 称为称为电泳电泳(elctrophoresis) 。根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳等。电泳等。 第91页/共104页SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质分子，常用于蛋白质分子量的测定。量的测定。等电聚焦电泳等电聚焦电泳，通过蛋白质等电点的差异而分，通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。离蛋白质的

43、电泳方法。双向凝胶电泳双向凝胶电泳是蛋白质组学研究的重要技术。是蛋白质组学研究的重要技术。n几种重要的蛋白质电泳:第92页/共104页四、应用相分配或亲和原理可将蛋白质进行层析分离待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的 。n层析(chromatography)分离蛋白质的原理第93页/共104页离子交换层析：离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。性质不同进行分离。凝胶过滤凝胶过滤(gel filtration)又称分子筛层析又称分子筛层析，利用各蛋白质分子大小不同分离。利用各蛋白质分子大小不同分离。n蛋白质分离常用的层析方法第94页/共104页第95页/共104页第96页/共104页五、利用蛋白质颗粒沉降行为不同可进行超速离心分离 超速离心法超速离心法(ultracentrifugation)既可以既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋用来分离纯化