生物化学第一章蛋白质

1、。第一章第一章 蛋白质蛋白质(Protein)(Protein) Whats Protein?蛋白质的生物学重要性蛋白质的生物学重要性 分布广：分布广：所有器官、组织都含有蛋白质；所有器官、组织都含有蛋白质； 细胞的各个部分都含有蛋白质。细胞的各个部分都含有蛋白质。 含量高：含量高：蛋白质是细胞内最丰富的有机分蛋白质是细胞内最丰富的有机分 子，占人体干重的子，占人体干重的4545，某些组某些组 织含量更高，例如脾、肺及横纹织含量更高，例如脾、肺及横纹 肌等高达肌等高达8080。 1. 蛋白质是生物体重要组成成分蛋白质是生物体重要组成成分作为生物催化剂（酶）作为生物催化剂（酶） 代谢调节作用代谢

2、调节作用 免疫保护作用免疫保护作用 物质的转运和存储物质的转运和存储 运动与支持作用运动与支持作用 参与细胞间信息传递参与细胞间信息传递 2. 2. 蛋白质具有重要的蛋白质具有重要的生物学功能生物学功能 3. 3. 氧化供能氧化供能 2. 蛋白质的化学组成n一.蛋白质的元素组成 主要的： C H O N S 5055% 68% 2023% 1518% 04% 微量的： P Fe Cu Zn Mo I Se 大多数蛋白质含氮量较恒定，平均16 %，即1g氮相当于6.25g蛋白质。 6.25称为蛋白质系数。 样品中蛋白质含量=样品中的含氮量 6.25 二.蛋白质的分子组成蛋白质蛋白质 月示 胨胨

3、多肽多肽 二肽二肽 氨基酸氨基酸 104 d 5103d 2103d 1035102d 2102d 102d 三.蛋白质的其他组分简单蛋白质简单蛋白质 结合蛋白质结合蛋白质 氨基酸部分氨基酸部分 非氨基酸部分非氨基酸部分 糖糖 脂脂 核酸核酸 辅因子辅因子 蛋白质分类分类 蛋白质是一类最重要的生物大分子，英文称protein，意为“最原初的，第一重要的”。分类分类单纯蛋白质（如清蛋白、球蛋白、组蛋白、谷蛋白、硬蛋白等）缀合蛋白质（如糖蛋白、脂蛋白、核蛋白、金属蛋白、黄素蛋白等）分类分类 ：按生物学功能可将蛋白质分为酶、调节蛋白、结构蛋白、转运蛋白等等；分类分类分类分类纤维状蛋白质（一般不溶于水

4、。典型的有：胶原蛋白、弹性蛋白、角蛋白、丝蛋白、肌球蛋白等）球状蛋白质（可溶性好。典型的有：胞质酶类等）膜蛋白（与细胞的膜系统结合而存在）单体蛋白质（寡）多聚蛋白质 组成人体蛋白质的组成人体蛋白质的20种氨基酸均属种氨基酸均属 于于 L- -氨基酸氨基酸（amino acidamino acid）除甘氨酸外，且均属除甘氨酸外，且均属 L-L- -氨基酸氨基酸自然界中的氨基酸自然界中的氨基酸300300余种余种人体蛋白质中人体蛋白质中的氨基酸的氨基酸2020种种L-L- - -氨基酸的结构通式氨基酸的结构通式COOH H 2 N C H R 共同部分共同部分侧链侧链13 - -氨基酸的立体异构体

5、（一）氨基酸的立体异构体（一） - -氨基酸的分子构型氨基酸的分子构型非极性脂肪族氨基酸非极性脂肪族氨基酸 极性中性氨基酸极性中性氨基酸 芳香族氨基酸芳香族氨基酸 酸性氨基酸酸性氨基酸 碱性氨基酸碱性氨基酸二、氨基酸二、氨基酸可根据侧链结构和理化可根据侧链结构和理化性质进行分类性质进行分类 含有非极性的侧链，含有非极性的侧链， 具有疏水性具有疏水性 GLyGLy（甘）、（甘）、AlaAla（丙）、（丙）、 VaLVaL（缬）、（缬）、LeuLeu（亮）、（亮）、 ILeILe（异亮）、（异亮）、ProPro（脯）（脯）1.1.侧链含烃链的氨基酸属于非极性侧链含烃链的氨基酸属于非极性脂肪族氨基酸

6、脂肪族氨基酸常见氨基酸的分类常见氨基酸的分类（1 1）R R为脂肪烃基的氨基酸（为脂肪烃基的氨基酸（5 5种）种）甘氨酸甘氨酸（Gly, GGly, G）丙氨酸丙氨酸（Ala, AAla, A）缬氨酸缬氨酸（Val, VVal, V）亮氨酸亮氨酸（Leu, LLeu, L）异亮氨酸异亮氨酸（Ile, I Ile, I ）按的化学结构分类）按的化学结构分类（2 2）R R中含有羟基和硫的氨基酸（中含有羟基和硫的氨基酸（4 4种）种）丝氨酸丝氨酸（Ser, SSer, S）苏氨酸苏氨酸（Thr, TThr, T）羟基氨基酸羟基氨基酸半胱氨酸半胱氨酸（Cys, CCys, C）甲硫氨酸甲硫氨酸（Me

7、t, MMet, M）蛋氨酸蛋氨酸含硫氨基酸含硫氨基酸nSerSer的的-CH-CH2 2 OH OH基（基（pKa=15pKa=15）在生理条件下不解离，）在生理条件下不解离，但在大多数酶的活性中心都发现有但在大多数酶的活性中心都发现有SerSer残基存在。残基存在。nSerSer和和ThrThr的的-OH-OH往往与糖链相连，形成糖蛋白。往往与糖链相连，形成糖蛋白。 nCysCys含巯基（含巯基（-SH-SH），具有两个重要性质：），具有两个重要性质：（1 1）在较高）在较高pHpH值条件，巯基离解。值条件，巯基离解。（2 2）两个）两个CysCys的巯基氧化生成二硫键，生成胱氨酸。的巯基

8、氧化生成二硫键，生成胱氨酸。n CysCys与结石与结石nMetMet在生物合成中是一种重要的在生物合成中是一种重要的甲基供体甲基供体。（3 3）R R中含有酰胺基团（中含有酰胺基团（2 2种）种）天冬酰氨天冬酰氨（Asn, NAsn, N）谷氨酰氨谷氨酰氨（Gln, QGln, Q）酰胺基中氨基易发酰胺基中氨基易发生氨基转移反应生氨基转移反应 （4 4） R R中含有酸性基团（中含有酸性基团（2 2种）种）天冬氨酸天冬氨酸（Asp, DAsp, D）谷氨酸谷氨酸（Glu, EGlu, E）生理条件下带有负电荷生理条件下带有负电荷 （5 5）R R中含碱性基团（中含碱性基团（3 3种）种）组氨

9、酸组氨酸（His, HHis, H）赖氨酸赖氨酸（Lys, KLys, K）精氨酸精氨酸（Arg, RArg, R）nLysLys侧链氨基的侧链氨基的pKapKa为为10.5310.53，生理条件下，生理条件下，LysLys侧链带有一侧链带有一个正电荷（个正电荷（NHNH3 3+ +），侧链的氨基反应活性增大。），侧链的氨基反应活性增大。 nArgArg是碱性最强的氨基酸，侧链上的胍基是已知碱性最强的是碱性最强的氨基酸，侧链上的胍基是已知碱性最强的有机碱，有机碱，pKapKa值为值为12.4812.48，生理条件下完全质子化。，生理条件下完全质子化。 nHisHis是是pKapKa值最接近生理

10、值最接近生理pHpH值的一种值的一种 （游离氨基酸中为（游离氨基酸中为6.006.00，在多肽链中为，在多肽链中为7.35 7.35 ） 生理生理pHpH条件下唯一具有缓冲能力的氨基酸条件下唯一具有缓冲能力的氨基酸nHisHis在酶的酸碱催化机制中起重要作用在酶的酸碱催化机制中起重要作用 （6 6）芳香族氨基酸）芳香族氨基酸苯丙氨酸苯丙氨酸（Phe, FPhe, F）酪氨酸酪氨酸（Tyr, YTyr, Y）色氨酸色氨酸（Trp, WTrp, W）l280nm280nm，TrpTrp吸收最强，吸收最强，TyrTyr次之，次之，PhePhe最弱最弱（7 7）杂环族氨基酸（）杂环族氨基酸（1 1种）

11、种）脯氨酸脯氨酸（Pro, PPro, P）组氨酸组氨酸（His, HHis, H）ProPro的的-亚氨基是环的一部亚氨基是环的一部分，因此具有特殊的刚性结构。分，因此具有特殊的刚性结构。几种特殊氨基酸几种特殊氨基酸 脯氨酸脯氨酸 （亚氨基酸）（亚氨基酸）CH2CHCOO-NH2+CH2CH2CH2CHCOO-NH2+CH2CH2-OOC-CH-CH2-S+NH3S-CH2-CH-COO-+NH3-OOC-CH-CH2-S+NH3S-CH2-CH-COO-+NH3 半胱氨酸半胱氨酸 +胱氨酸胱氨酸-HH-OOC-CH-CH2-SH+NH3-OOC-CH-CH2-SH+NH3HS-CH2-CH

12、-COO-+NH3HS-CH2-CH-COO-+NH3二硫键二硫键2)2)按照按照R R基的极性基的极性n4 4类类（1 1）非极性）非极性R R基团氨基酸基团氨基酸：8 8个个 Ala Val Leu Ile Pro Phe Trp MetAla Val Leu Ile Pro Phe Trp Met（2 2）极性）极性R R基团不带电荷氨基酸：基团不带电荷氨基酸：7 7个个 Gly Ser Thr Cys Tyr Asn GlnGly Ser Thr Cys Tyr Asn Gln（3 3）极性）极性R R基团带负电荷氨基酸：基团带负电荷氨基酸：2 2个个 Asp GluAsp Glu（4

13、 4）极性）极性R R基团带正电荷氨基酸：基团带正电荷氨基酸：3 3个个 His Lys ArgHis Lys Arg非极性氨基酸非极性氨基酸 9 9种种维持蛋白质的三维结构中起维持蛋白质的三维结构中起着重要作用着重要作用 （蛋白质的疏水核心）（蛋白质的疏水核心）n胶原蛋白中的胶原蛋白中的LysLys侧链氧化时能形成很强的分子间侧链氧化时能形成很强的分子间( (内内) )交联交联nArgArg：强碱，与：强碱，与NaOHNaOH相当。相当。nHisHis：弱碱，天然缓冲剂，它往往存在于许多酶的活性中心。：弱碱，天然缓冲剂，它往往存在于许多酶的活性中心。n非极性非极性aaaa一般形成蛋白质的疏水

14、核心，带电荷的一般形成蛋白质的疏水核心，带电荷的aaaa和极性和极性aaaa位位于表面。于表面。n酶的活性中心：酶的活性中心：HisHis、SerSer、CysCys修饰氨基酸：修饰氨基酸：胱氨酸胱氨酸 羟脯氨酸羟脯氨酸（Hyp） 羟赖氨酸羟赖氨酸（HyL）非生蛋白氨基酸：非生蛋白氨基酸： 瓜氨酸瓜氨酸 鸟氨酸鸟氨酸 同型半胱氨酸同型半胱氨酸4-4-羟脯氨酸（胶原蛋白）羟脯氨酸（胶原蛋白）5-5-羟赖氨酸（结缔组织）羟赖氨酸（结缔组织）修饰氨基酸修饰氨基酸p蛋白质合成后，由基本氨基酸修饰而来。蛋白质合成后，由基本氨基酸修饰而来。 p作用：作用：1. 1. 保护蛋白质保护蛋白质 2. 2. 使蛋

15、白质出现新的结构和功使蛋白质出现新的结构和功能能 （1 1）溶解性：）溶解性：水中的溶解度差别很大水中的溶解度差别很大 溶解于稀酸或稀碱溶解于稀酸或稀碱 不能溶解于有机溶剂（乙醇沉淀析出）不能溶解于有机溶剂（乙醇沉淀析出） （2 2）熔点：）熔点：熔点极高，一般在熔点极高，一般在200200以上。以上。（3 3）味感：）味感：不同氨基酸有所不同，无味、甜、苦不同氨基酸有所不同，无味、甜、苦 味精：谷氨酸钠盐味精：谷氨酸钠盐二二. .氨基酸的重要理化性质氨基酸的重要理化性质1.1.一般物理性质一般物理性质n无色结晶无色结晶, ,其形状因构型而异其形状因构型而异 n酪氨酸的酪氨酸的 max275n

16、m， 275=1.4x103;n苯丙氨酸的苯丙氨酸的 max257nm， 257=2.0 x102;n色氨酸的色氨酸的 max280nm， 280=5.6x103; 2.2.氨基酸的离解性质氨基酸的离解性质n氨基酸在结晶形态或在水溶液中，并不是以游离的羧基或氨基形式存在，而是离解成两性离子。在两性离子中，氨基是以质子化(-NH3+)形式存在，羧基是以离解状态(-COO-)存在。n在不同的pH条件下，两性离子的状态也随之发生变化CO O HCHH3N+R-pK1+H+H+C O O-CHH3N+RH+H+p K2-C O O-CHH2NRPH 1 7 10净电荷 +1 0 -1 正离子 两性离子

17、 负离子 等电点PIH3NCHCOOHR+（pHpI）H3NCHCOO-R+（pH=pI）H2NCHCOO-R（pHpI）氨基酸的解离氨基酸的解离Ka1*Ka2=l侧链不含离解基团的中性侧链不含离解基团的中性AAAAlpI = (pK1 + pK2 )/2 甘氨酸滴定曲线甘氨酸滴定曲线n对于侧链含有可解离基团的对于侧链含有可解离基团的AAAAnp pI I取决于两性离子两边取决于两性离子两边p pK K值的算术平均值的算术平均值值n酸性酸性AAAA：p pI I = (p = (pK K1 1 + p + pK KR-COOR-COO- - )/2 )/2 n碱性碱性AAAA：p pI I =

18、 (p = (pK K2 2 + p + pK KR-NH2 R-NH2 )/2 )/2 3.氨基酸的等电点氨基酸的等电点 当溶液浓度为某一当溶液浓度为某一pH值时，氨基酸分子中所含的值时，氨基酸分子中所含的-NH3+和和-COO-数目正好相等，净电荷为数目正好相等，净电荷为0。这一。这一pH值即为氨基酸的值即为氨基酸的等电点，简称等电点，简称pI。在等电点时，氨基酸既不向正极也不向负极。在等电点时，氨基酸既不向正极也不向负极移动，即氨基酸处于两性离子状态。移动，即氨基酸处于两性离子状态。 侧链不含离解基团的中性氨基酸，其等电点是它的侧链不含离解基团的中性氨基酸，其等电点是它的pK1和和pK2

19、的算术平均值：的算术平均值：pI = (pK1 + pK2 )/2 同样，对于侧链含有可解离基团的氨基酸，其同样，对于侧链含有可解离基团的氨基酸，其pI值也决定值也决定于两性离子两边的于两性离子两边的pK值的算术平均值。值的算术平均值。 酸性氨基酸：酸性氨基酸：pI = (pK1 + pKR-COO- )/2 硷性氨基酸：硷性氨基酸：pI = (pK2 + pKR-NH2 )/2 4.氨基酸的化学性质氨基酸的化学性质(1)与茚三酮的反应（颜色反应）与茚三酮的反应（颜色反应）氨基酸等电点（氨基酸等电点（PI）的计算）的计算中性氨基酸：PI=1/2（pk1+pK2)酸性氨基酸： PI=1/2（pk

20、1+pKR-COO-)碱性氨基酸： PI=1/2（pk2+pKR-NH2) 氨基酸与水合茚三酮共热，发生氧化脱氨反应，生成NH3与酮酸。水合茚三酮变为还原型茚三酮。加热过程中酮酸裂解，放出CO2，自身变为少一个碳的醛。水合茚三酮变为还原型茚三酮。NH3与水合茚三酮及还原型茚三酮脱水缩合，生成蓝紫色化合物。n反应要点A.该反应由NH2与COOH共同参与B.茚三酮是强氧化剂C.该反应非常灵敏，可在570nm测定吸光值D. 测定范围：0.550g/ml E.脯氨酸与茚三酮直接生成黄色物质（不释放NH3）n应用：A.氨基酸定量分析（先用层析法分离）B.氨基酸自动分析仪： 用阳离子交换树脂，将样品中的氨

21、基酸分离，自动定性定量，记录结果。(2)与甲醛反应与甲醛反应 n反应特点A.为- NH2的反应B.在常温，中性条件，甲醛与- NH2很快反应，生成羟甲基衍生物，释放氢离子。n应用：氨基酸定量分析甲醛滴定法（间接滴定）A.直接滴定，终点pH过高（12），没有适当指示剂。B.与甲醛反应，滴定终点在9左右，可用酚酞作指示剂。C.释放一个氢离子，相当于一个氨基（摩尔比1：1）D.简单快速，一般用于测定蛋白质的水解速度。(3) 与与2,4-二硝基氟苯（二硝基氟苯（DNFB）反应）反应 n反应特点A.为- NH2的反应B.氨基酸- NH2的一个H原子可被烃基取代(卤代烃)C.在弱碱性条件下，与DNFB发生

22、芳环取代，生成二硝基苯氨基酸n应用：鉴定多肽或蛋白质的N-末端氨基酸A.虽然多肽侧链上的- NH2、酚羟基也能与DNFB反应，但其生成物，容易与- DNP氨基酸区分和分离 首先由Sanger应用，确定了胰岛素的一级结构A.B.水解DNP-肽，得DNP-N端氨基酸及其他游离氨基酸C.分离DNP-氨基酸D.n由Edman于1950年首先提出n为- NH2的反应n用于N末端分析，又称Edman降解法肽分子与DNFB反应，得DNP-肽层析法定性DNP-氨基酸，得出N端氨基酸的种类、数目(4)与异硫氰酸苯酯（与异硫氰酸苯酯（PITC）的反应）的反应 nEdman （苯异硫氰酸酯法）氨基酸顺序分析法实际上

23、也是一种N-端分析法。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。NCSNHCHCOR2NCHCOR1HHNHS:CCHCOR1HNNHCHCOR2SNHCNHOCR1CHNH2CHCOR2NCOCHNHSCR1 肽链（N端氨基酸）与PITC偶联，生成PTC-肽环化断裂：最靠近PTC基的肽键断裂，生成PTC-氨基酸和少 一残基的肽链，同时PTC-氨基酸环化生成PTH-氨基酸分离PTH-氨基酸层析法鉴定nEdman降解法的改进方法- DNS-Edman降解法n用DNS(二甲基萘磺酰氯)测定N端氨基酸n原理DNFB法相同n但水解后的DNS-氨基酸不需分离，可直接用电泳或

24、层析法鉴定n由于DNS有强烈荧光，灵敏度比DNFB法高100倍，比Edman法高几到十几倍n可用于微量氨基酸的定量 n用Edman降解法提供逐次减少一个残基的肽链n灵敏度提高，能连续测定。n多肽顺序自动分析仪n样品最低用量可在5pmol（5）与荧光胺的反应）与荧光胺的反应 - NH2的反应氨基酸定量（6）与）与5,5-双硫基双硫基-双双(2-硝基苯甲酸硝基苯甲酸)反应反应-SH的反应测定细胞游离- SH的含量（7）其他反应）其他反应成盐、成酯、成肽、脱羧反应 4. 肽n一.肽的概念 肽 肽键 肽链 N端 C端 二肽 三肽 多肽 寡肽 多肽链 氨基酸残基 肽单位n二.肽的命名n三.肽的理化性质

25、1.在晶体或溶液中以两性离子状态存在 2.熔点高 3.其酸碱性决定于N端氨基、C端羧基和侧链R基 4.双缩脲反应 5.与氨基酸类似的反应：DNFB DNS PITC 反应等 四.常见的多肽（天然活性肽）肽的概念肽的概念肽和肽键氨基酸残基及肽单位肽单元肽单元(peptide unit) 示意图示意图肽键的特点肽键的特点1.一般的C-N单键 肽键C-N 一般的C=N双键 （键长1.49 ) （键长1.32） （键长1.27) 因此具有部分双键的性质，不能沿C-N自由旋转2.C=O和NH2中的O原子与H原子成反式排列3.与C-N键相连的N-C和C-C可以自由旋转，其 旋转角分别为和。 和称为二面角，

26、可描述多肽的所有可能构象。 4.肽键中的四个原子和它相邻的两个C处于同一 平面，形成酰胺平面。 谷胱甘肽（谷胱甘肽（GSH）- 3.天然存在的重要多肽天然存在的重要多肽 在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚单位。但是，也有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在。这类多肽通常都具有特殊的生理功能，常称为活性肽。如：脑啡肽；激素类多肽；抗生素类多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。NHCOC H2N HCOC HN HCOC H3C HC HO HC H2O HC HH NCN HC HCN HC H2CCOC HNHH OC H2N HN HC HC HC H3C H2C H3COOOOC H2

27、C H2SOO H鹅 膏 覃 碱 的 化 学 结 构蛋白质与多肽的区别：蛋白质与多肽的区别：氨基酸残基氨基酸残基 数目数目稳定的稳定的 空间结构空间结构50 50 蛋白质蛋白质50 50 多肽多肽不稳定的空间结构不稳定的空间结构 多肽多肽稳定的空间结构稳定的空间结构 蛋白质蛋白质 蛋白质的结构 二二.蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构 1. 蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构(Primary structure)包括：包括： (1)组成蛋白质的多肽链数目. (2)多肽链的氨基酸顺序， (3)多肽链内或链间二硫键的数目和位置。 其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础。2.蛋白质的

28、一级结构的测定蛋白质的一级结构的测定 蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从1953年F.Sanger测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被测定。(1) 测定蛋白质的一级结构的要求测定蛋白质的一级结构的要求 一级结构（1 1）结构特点）结构特点l多为右手螺旋；多为右手螺旋；l多肽链主链骨架围绕中心轴螺旋式多肽链主链骨架围绕中心轴螺旋式 上升，每上升一圈为上升，每上升一圈为3.6 3.6 个残基；个残基；l每个残基沿中心轴上升每个残基沿中心轴上升0.15 nm0.15 nm，旋转旋转 100100 右手型- 螺旋 在-螺旋中肽平面的键长和键角一定,肽键的原

29、子排列呈反式构型,相邻的肽平面构成两面角.多肽链中的各个肽平面围绕同一轴旋转，形成螺旋结构，螺旋一周，沿轴上升的距离即螺距为0.54nm,含3.6个氨基酸残基；两个氨基酸之间的距离0.15nm.肽链内形成氢键，氢键的取向几乎与轴平行，第一个氨基酸残基的酰胺基团的-CO基与第四个氨基酸残基酰胺基团的-NH基形成氢键。蛋白质分子为右手-螺旋。左手和右手螺旋左手和右手螺旋氢键 R基大小：较大的难形成，如多聚基大小：较大的难形成，如多聚Ile R基的电荷性质：不带电荷易形成基的电荷性质：不带电荷易形成 Pro吡咯环的形成吡咯环的形成 C -N /C -N不能不能旋转旋转 无法形成链内氢键无法形成链内氢

30、键影响影响 -螺旋形成的因素螺旋形成的因素结构要点：结构要点： - -折叠折叠（ -pleated sheet） 使多肽链形成片层结使多肽链形成片层结构构nC 总是处于折叠的角上总是处于折叠的角上nAA的的R基团处于折叠的棱角上并与之垂直基团处于折叠的棱角上并与之垂直n两个两个AA之间的轴心距为之间的轴心距为0.35nm - -折叠结构特点折叠结构特点n氢键主要在链间氢键主要在链间/ /同一肽链不同部分间形成同一肽链不同部分间形成n几乎所有肽键都参与链内氢键的交联几乎所有肽键都参与链内氢键的交联n氢键与链的长轴接近垂直氢键与链的长轴接近垂直n平行肽链间以氢键从侧面连接的构象平行肽链间以氢键从侧

31、面连接的构象 蛋白质的-折迭是蛋白质的一种二级结构肽链伸展，且按层排列，相邻肽链的长轴相互平行，链间氢键与长轴接近垂直，靠相邻肽链间氢键维持结构稳定性，氨基酸残基的轴心距为3.5 （3） -转角转角在-转角部分，由四个氨基酸残基组成.四个形成转角的残基中，第三个一般均为甘氨酸残基弯曲处的第一个氨基酸残基的 -C=O 和第四个残基的 N-H 之间形成氢键，形成一个不很稳定的环状结构。这类结构主要存在于球状蛋白分子中。（）自由回转（）自由回转没有一定规律的松散肽链结构，但仍是紧密有序的稳定结构，通过主链间及主链与侧链间氢键维持其构象不同的蛋白质，自由回转的数量和形式各不相同分两类： 紧密环 连接条

32、带超二级结构和结构域超二级结构和结构域（）超二级结构（）超二级结构在蛋白质分子中，由若干相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互作用，形成有规则的、在空间上能辨认的二级结构组合体。几种类型的超二级结构： ；超二级结构在结构超二级结构在结构层次上高于二级结构，但层次上高于二级结构，但没有聚集成具有功能的结没有聚集成具有功能的结构域构域 蛋白质的超二级结构蛋白质的超二级结构 这是由这是由相邻的二级结构单位组合在一起，形成的有规则的、在空间上能辨认的二级结构组合体。二级结构组合体。a-发夹结构-发夹a-结构模体模体是具有特殊功能的是具有特殊功能的 超二级结构超二级结构在许多蛋白质分子中，可发现二个或三

33、在许多蛋白质分子中，可发现二个或三个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个形成一个有规则的二级结构组合，被称为有规则的二级结构组合，被称为超超二级结构或模体二级结构或模体(motif) 。二级结构组合形式有二级结构组合形式有3 3种：种： ， 。钙结合蛋白中结合钙结合蛋白中结合钙离子的模体钙离子的模体锌指结构锌指结构- -螺旋螺旋-转角（或转角（或环）环）-螺旋模体螺旋模体 链链-转角转角- -链模体链模体 链链-转角转角-螺旋螺旋-转角转角- -链模体链模体n模体常见的形式模体常见的形式（）结构域（）结构域 对于较大的蛋白质分子或亚基，多肽链往

34、往由两个或两个以上相对独立的三维实体缔合而成三级结构。这种相对独立的三维实体就称结构域。结构域通常是几个超二级结构的组合，对于较小的蛋白质分子，结构域与三级结构等同，即这些蛋白为单结构域。结构域一般由100200 个氨基酸残基组成，但大小范围可达 40400 个残基。氨基酸可以是连续的，也可以是不连续的结构域之间常形成裂隙，比较松散，往往是蛋白质优先被水解的部位。酶的活性中心往往位于两个结构域的界面上结构域之间由“铰链区”相连，使分子构象有一定的柔性，通过结构域之间的相对运动，使蛋白质分子实现一定的生物功能。 在蛋白质分子内，结构域可作为结构单位进行相对独立的运动，水解出来后仍能维持稳定的结构

35、，甚至保留某些生物活性核糖核酸酶分子中的二级结构核糖核酸酶分子中的二级结构-螺旋螺旋-折叠折叠-转角转角无规卷曲无规卷曲 结构域与功能域的关系：结构域与功能域的关系：有时一个结构域就是蛋白质的功能域，但不总是包含一个但通常是多个结构域蛋白质的三级结构蛋白质的三级结构蛋白质的三级结构是指多肽链在二级结构的基础上进一步盘旋、折叠，从而生成特定的空间结构。包括主链和侧链的所有原子的空间排布一般非极性侧链埋在分子内部，形成疏水核，极性侧链在分子表面肌红蛋白的三级结构a 蛋白蛋白a+蛋白a/蛋白维系蛋白质三维结构的作用力蛋白质的四级结构蛋白质的四级结构许多蛋白质是由两个或两个以上独立的三级结构通过非共价

36、键结合成的多聚体，称为寡聚蛋白。寡聚蛋白中的每个独立三级结构单元称为亚基。蛋白质的四级结构是指亚基的种类、数量以及各个亚基在寡聚蛋白质中的空间排布和亚基间的相互作用。如，血红蛋白的四级结构得测定由佩鲁茨1958年完成，其结构要点为：球状蛋白，寡聚蛋白，含四个亚基两条链，两条链，22 链：141个残基； 链：146个残基分子量65 000含四个血红素辅基亲水性侧链基团在分子表面，疏水性基团在分子内部蛋白质四级结构的结构特征分子伴侣参与蛋白质折叠分子伴侣参与蛋白质折叠 分子伴侣分子伴侣(chaperon)(chaperon)通过提供一个保护环境从通过提供一个保护环境从 而加速蛋白质折叠成天然构象或

37、形成四级结构。而加速蛋白质折叠成天然构象或形成四级结构。* * 分子伴侣可逆地与未折叠肽段的疏水部分结合随分子伴侣可逆地与未折叠肽段的疏水部分结合随后松开，如此重复进行可防止错误的聚集发生，后松开，如此重复进行可防止错误的聚集发生，使肽链正确折叠。使肽链正确折叠。 * * 分子伴侣也可与错误聚集的肽段结合，使之解聚分子伴侣也可与错误聚集的肽段结合，使之解聚后，再诱导其正确折叠。后，再诱导其正确折叠。 * * 分子伴侣在蛋白质分子折叠过程中二硫键的正分子伴侣在蛋白质分子折叠过程中二硫键的正确形成起了重要的作用。确形成起了重要的作用。 三蛋白质分子中的共价键与次级键三蛋白质分子中的共价键与次级键一

38、级结构二级结构超二级结构结构域三级结构亚基四级结构维系蛋白质分子的一级结构：肽键、二硫键维系蛋白质分子的二级结构：氢键维系蛋白质分子的三级结构：疏水相互作用力、氢键、范德华力、盐键维系蛋白质分子的四级结构：范德华力、盐键 a盐键（离子键 ） b氢键 c疏水相互作用力 d 范德华力 e二硫键 f 酯键氢键、范德华力、疏水相互作用力、盐键，均为次级键氢键、范德华力虽然键能小，但数量大疏水相互作用力对维持三级结构特别重要盐键数量小二硫键对稳定蛋白质构象很重要，二硫键越多，蛋白质分子构象越稳定离子键离子键氢键氢键范德华力范德华力疏水相互作用力疏水相互作用力第四节第四节 蛋白质分子结构与功能的关系蛋白质

39、分子结构与功能的关系一一.蛋白质一级结构与功能的关系蛋白质一级结构与功能的关系 研究蛋白质一级结构与功能的关系主要是：研究多肽链中不同部位的残基与生物功能的关系。 进行这方面的研究常用的方法有：同源蛋白质氨基酸顺序相似性分析、氨基酸残基的化学修饰及切割实验等。 例例1 镰刀形贫血病镰刀形贫血病l患者血红细胞合成了一种不正常的血红蛋白（Hb-S）l它与正常的血红蛋白（Hb-A）的差别：仅仅在于链的N-末端第6位残基发生了变化l（Hb-A）第6位残基是极性谷氨酸残基，（Hb-S）中换成了非极性的缬氨酸残基l使血红蛋白细胞收缩成镰刀形，输氧能力下降，易发生溶血l这说明了蛋白质分子结构与功能关系的高度

40、统一性正常血红细胞镰刀状红细胞贫血蛋白质的一级结构的变异与分子病n氨基酸顺序 1 2 3 4 5 6 7 8n HbA Val.His.Leu.Thr.Pro.Glu.Glu.Lysn HbS Val.His.Leu.Thr.Pro.Val.Glu.Lys例例2 一级结构的局部断裂与蛋白质的激一级结构的局部断裂与蛋白质的激活活 体内的某些蛋白质分子初合成时，常带有抑制肽，呈无活性状态，称为蛋白质原.蛋白质原的部分肽链以特定的方式断裂后，才变为活性分子.例：胰岛素，在刚合成时，是一个比成熟的胰岛素分子大一倍多的单链多肽，称为前胰岛素原前胰岛素原的N-末端有一段肽链，称为信号肽.信号肽被切去，剩下

41、的是胰岛素原。胰岛素原比胰岛素分子多一段C肽，只有当C肽被切除后才成为有51个残基，分A、B两条链的胰岛素分子单体.疯牛病中的蛋白质构象改变疯牛病中的蛋白质构象改变 疯牛病是由疯牛病是由朊病毒蛋白朊病毒蛋白(prion protein,(prion protein, PrP)PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。引起的一组人和动物神经退行性病变。 正常的正常的PrPPrP富含富含-螺旋螺旋，称为，称为PrPPrPc c。 PrPPrPc c在某种未知蛋白质的作用下可转变在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为成全为-折叠的折叠的PrPPrPscsc，从而致病。，从而致病。PrPPrPc c -

42、螺旋螺旋PrPPrPsc sc -折叠折叠正常正常疯牛病疯牛病例例3 同源蛋白同源蛋白 同源蛋白：是指在不同有机体中实现同一功能的蛋白质.同源蛋白中的一级结构中有许多位置的氨基酸对所有种属来说都是相同的，称为不变残基；其他位置的氨基酸称可变残基.不同种属的可变残基有很大变化.可用于判断生物体间亲缘关系的远近.例：细胞色素Cl60 个物种中，有 27 个位置上的氨基酸残基完全不变，是维持其构象中发挥特有功能所必要的部位，属于不变残基.l可变残基可能随着进化而变异，而且不同种属的细胞色素 C氨基酸差异数与种属之间的亲缘关系相关。亲缘关系相近者，氨基酸差异少，反之则多（进化树）.细胞色素C进化树黄色

43、： 不变残基（invariable residues）蓝色 ： 保守氨基酸（conservative residues）未标记：可变残基（variable residues）二二.蛋白质的构象与功能的关系蛋白质的构象与功能的关系 别构效应：又称变构效应，是指寡聚蛋白与配基结合，改变蛋白质构象，导致蛋白质生物活性改变的现象.它是细胞内最简单的调节方式.例：血红蛋白的别构效应一个亚基与氧结合后，引起该亚基构象改变进而引起另三个亚基的构象改变整个分子构象改变与氧的结合能力增加卟啉铁卟啉铁n肌红蛋白肌红蛋白 血红蛋白血红蛋白 血红蛋白血红蛋白 肌红蛋白肌红蛋白 / 血红蛋白血红蛋白 / 血红蛋白血红蛋

44、白lAAAA序列大不相同，结构相似序列大不相同，结构相似l结构决定功能（载氧）结构决定功能（载氧）n氧分数饱和度（氧分数饱和度（fractional satuation ） 肌红蛋白分子总数肌红蛋白分子总数氧合肌红蛋白分子数氧合肌红蛋白分子数nY=1 Mb被氧完全饱和被氧完全饱和nY=0.5 p(O2)=K=P50P50 ：Mb被氧半饱和时的氧分压被氧半饱和时的氧分压YMb氧结合氧结合/ /解离曲线解离曲线在氧分压不变时，低在氧分压不变时，低pH能促进更多的氧释放能促进更多的氧释放Bohr效应效应 第五节第五节 蛋白质的性质蛋白质的性质一一.蛋白质的分子大小蛋白质的分子大小蛋白质是分子量很大的

45、生物分子，相对分子质量大于10 000.最高可达40 000 000（烟草花叶病毒） 蛋白质相对分子质量的测定方法蛋白质相对分子质量的测定方法1.根据化学成分测定最小相对分子质量根据化学成分测定最小相对分子质量 此法首先利用化学分析方法测定蛋白质分子中某一特殊成分的百分含量然后，假定蛋白质分子中该成分只有一个，据其百分含量可计算出最低相对分子质量：最小相对分子质量（已知成分的相对分子、原子质量）/已知成分的百分含量如果蛋白质分子中所含已知成分不是一个单位，则真实相对分子质量等于最小相对分子质量的倍数。2. 超离心法超离心法在60 00080 000r/min的高速离心力作用下，蛋白质分子会沿旋

46、转中心向外周方向移动用光学方法测定界面移动的速度即为蛋白质的离心沉降速度蛋白质的沉降速度与分子大小和形状有关沉降系数是溶质颗粒在单位离心场中的沉降速度，用S表示。一个S单位，为110-13秒相对分子质量越大，S值越大蛋白质的沉降系数：1200S 由沉降系数S可根据斯维得贝格Svedberg方程计算蛋白质分子的相对分子质量： M=RST/D1i R：气体常数 T：绝对温度 D：扩散系数 ：溶剂的密度3.凝胶过滤法凝胶过滤法凝胶过滤所用介质为凝胶珠，其内部为多孔网状结构一定型号的凝胶网孔大小一定，只允许相应大小的分子进入凝胶颗粒内部，大分子则被排阻在外洗脱时大分子随洗脱液从颗粒间隙流下来，洗脱液体

47、积小；小分子在颗粒网状结构中穿来穿去，历程长，后洗脱下来，洗脱体积大测定蛋白质分子量一般用葡聚糖，商品名：Sephadex测得几种标准蛋白质的洗脱体积Ve以相对分子质量对数（logM）对Ve作图，得标准曲线再测出未知样品洗脱体积Ve从标准曲线上可查出样品蛋白质的相对分子质量4.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法聚丙烯酰胺凝胶电泳法SDS:十二烷基硫酸钠，变性剂普通蛋白质电泳的泳动速率取决于荷质比（净电荷、大小、形状）用SDS和巯基乙醇（打开二硫键）处理蛋白质变性（肽链伸展）并与SDS结合，形成SDS-蛋白质复合物不同蛋白质分子的均带负电（SDS带负电）；且荷质比相同（蛋白质分子大，结合SDS多；分子

48、小，结合SDS少）不同蛋白质分子具有相似的构象用几种标准蛋白质相对分子质量的对数值对它们的迁移率作图测出待测样品的迁移率从标准曲线上查出样品的相对分子质量血液透析血液透析小分子溶出小分子被带出小分子被带出透析机透析机透析液透析液加加压压血液血液2 2、密度梯度（区带）离心、密度梯度（区带）离心6000080000转/分重力60万80万倍 影响迁移率的主要因素影响迁移率的主要因素凝胶的分子筛效应对长短不同的棒形分子会 产 生不同的阻力主要因素凝胶的浓度和交联度同一电泳条件下，分子小，受阻小，游动快，迁移率大。相对分子质量大者，迁移率小 优点：优点：快速，样品用量少，可同时测几个样品 缺点：缺点：

49、误差大，约为10（误差主要来源于迁移距离的测量误差） 此方法只能测得此方法只能测得 亚基肽链的相对分子质量亚基肽链的相对分子质量二. 蛋白质的两性离解和电泳现象蛋白质的两性离解和电泳现象蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解，也有等电点。在等电点时(Isoelectric point pI)，蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。在不同的pH环境下，蛋白质的电学性质不同。在等电点偏酸性溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动；在等电点偏碱性溶液中，蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动。这种现象称为蛋白质电泳(Electrophoresis)。 蛋白质含有酸蛋白质含有酸/ /碱碱AAAA残基具

50、有两性残基具有两性 碱碱/ /酸越大酸越大pI pI 越大越大npI通常在通常在 6.0 左右左右蛋白质的两性电离及等电点蛋白质在等电点pH条件下，不发生电泳现象。利用蛋白质的电泳现象，可以将蛋白质进行分离纯化。三三.蛋白质的胶体性质蛋白质的胶体性质由于蛋白质的分子量很大，它在水中能够形成胶体溶液。蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质，如丁达尔现象、布郎运动等。由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。四四.蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关。改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来。 1

51、.(1)在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。(2) 在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀。(3)可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。(1)在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。(2)由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。(3)如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。 蛋白质的性质与它们的结构密切相关。某些物理

52、或化学因素，能够破坏蛋白质的结构状态，引起蛋白质理化性质改变并导致其生理活性丧失。这种现象称为蛋白质的变性.蛋白质的蛋白质的沉淀沉淀 Pr从胶体溶液中析出从胶体溶液中析出 可逆沉淀：可逆沉淀：n温和条件，改变溶液温和条件，改变溶液pH或或Pr所所带电荷带电荷nPr结构和性质没有变化结构和性质没有变化n适当条件下可重新溶解适当条件下可重新溶解 非变性沉淀非变性沉淀npI沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等 不可逆沉淀不可逆沉淀n强烈沉淀条件强烈沉淀条件n破坏破坏Pr胶体溶液稳定性胶体溶液稳定性n也破坏也破坏Pr结构和性质结构和性质n沉淀不能再重新溶解沉淀不能再重新溶解

53、变性沉淀变性沉淀n如加热沉淀、强酸如加热沉淀、强酸/ /碱沉淀、重金属盐碱沉淀、重金属盐 和生物碱沉淀等和生物碱沉淀等.1.1.盐析法盐析法加入中性盐脱去蛋白质的水化层，加入中性盐脱去蛋白质的水化层，盐析一般不引起变性盐析一般不引起变性n等电点沉淀的蛋白质溶液中等电点沉淀的蛋白质溶液中加入加入NaCl后沉后沉淀溶解淀溶解盐溶盐溶n原因？原因？盐溶盐溶盐析盐析分子在等电点时，相互吸引，聚合沉淀，分子在等电点时，相互吸引，聚合沉淀，加入少加入少量盐离子量盐离子后破坏了这种吸引力，使分子分散，溶后破坏了这种吸引力，使分子分散，溶于水中于水中盐溶盐析n向蛋白质溶液中加入大量硫酸铵后蛋白向蛋白质溶液中加

54、入大量硫酸铵后蛋白质会沉淀析出质会沉淀析出n原因？原因？蛋白质脱去水化层而聚集沉淀盐析（NH4）2SO4）2.2.有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀脱去水化层以及降低介电常数而增脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点间的相互作用加带电质点间的相互作用3.3.等电点沉淀等电点沉淀4.4.重金属盐沉淀重金属盐沉淀 与带负电荷蛋白质结成不溶性盐与带负电荷蛋白质结成不溶性盐5.5.生物碱试剂和某些酸类沉淀生物碱试剂和某些酸类沉淀 与带正电荷蛋白质生成不溶性盐与带正电荷蛋白质生成不溶性盐6.6.加热变性沉淀加热变性沉淀 天然结构解体，疏水基外露，天然结构解体，疏水基外露， 破坏水化层及带电状态破坏水化层及带电状

55、态 变性蛋白质通常都是固体状态物质，不溶于水和其它溶剂，也不可能恢复原有蛋白质所具有的性质。所以，蛋白质的变性通常都伴随着不可逆沉淀。引起变性的主要因素是热、紫外光、激烈的搅拌以及强酸和强碱等。大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。这三种氨基酸的在280nm 附近有最大吸收。因此，大多数蛋白质在280nm 附近显示强的吸收。利用这个性质，可以对蛋白质进行定性鉴定。七七.蛋白质的颜色反应蛋白质的颜色反应1.双缩脲反应：双缩脲反应： 两分子双缩脲与碱性硫酸铜作用，生成粉红色的复合物含有两个或两个以上肽键的化合物，能发生同样的反应肽键的反应，肽键越多颜色越深受蛋白质特异性影响小蛋白质定量测定；测定蛋白质水解程度 2.米伦氏反应米伦氏反应酪氨酸的显色反应（酚羟基反应）米伦试剂为硝酸、亚硝酸、硝酸汞、亚硝酸汞的混合物蛋白溶液中，加入米伦试剂，产生白色沉