电泳技术的临床应用完整版ppt课件

1、现代电泳技术的临床应用现代电泳技术的临床应用1电泳技术就是利用在电场的作用下, 由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小, 形状等性质的差异, 使带电分子产生不同的迁移速度, 从而对样品进行分离, 鉴定或提纯的技术.在生化检测中, 主要用于分离各类蛋白分子.21809年俄国科学家列伊斯首先发现电泳现象1937年瑞典科学家Tiselius建立了界面电泳技术, 并首次证明了血清是由白蛋白及, , 球蛋白组成的因此获得1948年诺贝尔化学奖.1950年后, 区带电泳从发展到成熟. 1980年以来, 毛细管电泳逐渐受到重视3滤纸电泳醋酸纤维素薄膜电泳凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 : 琼脂糖凝胶适用于

2、蛋白质和核酸的电泳支持介质, 成本低, 结果易保存.聚丙烯酰胺凝胶电泳 : 最常用的定性分析蛋白质的电泳方法, 特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量, 一般用于科研.毛细管电泳 :经典电泳技术和现代微柱分离相结合的产物4蛋白质电泳分析是实验室必备的检测手段, 可全面精确, 描绘出患者蛋白质的全貌. 对疾病的早期诊断, 疗效观察及预后判断具有非常重要的临床价值.5根据使用的染料或者是底物的不同，我们可以检测到不同类型的蛋白: 血清蛋白 脂蛋白(运送脂类) 各种酶类血红蛋白6急,慢性炎症造血系统疾病: 多发性骨髓瘤, 巨免疫球蛋白血症肾脏疾病肝脏疾病中枢神经系统疾病: 多发性硬化症o 遗传性

3、疾病: 地中海贫血o 代谢性疾病: 糖尿病o 心血管疾病: 心梗,动脉粥样硬化o 恶性肿瘤789gba2白蛋白a1: a1酸性糖蛋白, a1抗胰蛋白酶: 结合珠蛋白, a2 巨球蛋白, a脂蛋白, 铜蓝蛋白: 转铁蛋白, 血液结合素, C3补体, b脂蛋白: 免疫球蛋白血清蛋白电泳10血清蛋白电泳后会呈现出5 或者 6 条带.染色后,每个条带呈现出的不同程度的染色对应着各自的蛋白浓度.如何检测染色程度: 需要使用光密度仪.11正常的电泳图谱12 出现单克隆免疫球蛋白的电泳图谱13制备胶片,加样,启动电源,开始电泳,染色, 脱色,结果检测14检测异常 :含量的变化 : 条带中蛋白含量的增加或减少

4、性质的变化 : 异常条带的出现15将电泳作为常规检测之一, 基于蛋白含量的变化, 有助于我们对以下疾病的筛查 :炎症 营养不良肺气肿16对异常条带的筛查,有助于我们检测下列疾病: 骨髓瘤 巨球蛋白血症(Waldenstrom)细菌和病毒感染在这些情况下, 必须要做其他辅助测试, 比如说免疫固定, 使用不同类型的抗血清对异常蛋白进行检测. (对于后期治疗有很重要的指导意义) 17电泳检测电泳检测18qA/G比例变化q血液沉降速度发生异常变化q出现恶性疾病征兆q在免疫球蛋白定量检测中发现 某一种免疫球蛋白出现大量异常增加19电泳区带分析20双白蛋白,或者一条宽峰,或者在白蛋白条带出现附属条带可能是

5、由以下原因造成 :- 遗传性双白蛋- 暂时性的双白蛋白血症可能是由于药物刺激导致的- 急性胰腺炎导致的双白蛋白血症 : 大量的胰酶的出现可以导致白蛋白降解白蛋白区带21双白蛋白血症 22双白蛋白血症2324q在下列情况下白蛋白会出现下降 :- 肾病综合症, 蛋白流失, 胃肠病: 检查尿蛋白- 淋巴细胞增生综合征- 营养不良- 肝脏功能不全- 慢性炎症- 严重烧伤- 血液稀释25q在下列情况中白蛋白会出现增加:- 脱水症状- 血液浓缩- 白蛋白注射26q将会在下列情况下出现下降:- 蛋白流失- 肝功能不全- 先天性抗胰蛋白酶缺乏症q出现两个条带:- 抗胰蛋白酶的不同基因型q出现增加:- 炎症症状

6、27A1AT不同的基因型 282930q下列情况中出现下降:- 肝功能不全- 血管内溶血31q 出现两个条带:- 溶血标本 (结合珠蛋白-血红蛋白复合体)- 结合珠蛋白不同基因型- 出现单克隆免疫球蛋白(带有大量负电荷) *Alpha 2条带在电泳图谱中,是一个很特殊的条带. 因为这一条带中含有五种蛋白: HDL, Haptoglobin, Alpha 2 Macroglobulin, Ceruloplasmin and Gc globulin. 由于结合珠蛋白有不同的基因表现型, 增加了这一条带的复杂程度. 结合珠蛋白非常靠近Alpha 1条带; 出现溶血时结合珠蛋白的迁移率会发生改变. 同

7、时,由于HDL的含量或者是存放过久的标本, HDL的迁移速度可能会更快.32溶血的标本33出现在a2区域的单克隆免疫球蛋白34q下列情况下Alpha2区域会出现增加现象: - 炎症症状- 肾病综合征- 出现游离轻链 35肾病综合征363738q在下列情况下会出现下降 :- 肝功能不全- C3 长期缺乏 或者 C3 代谢过快 (also in aging sample,C3 denaturation, splitted in up to 4 fractions: 1 between a2 and b, 1 on b1, 1 on b2 and 1 on g) 39q在下列情况下会出现两个条带:-

8、 长期存放的标本或者是高胆固醇的标本, LDL 有不同的迁移率; 从而导致LDL电泳是偏移 Beta位置 40q Beta球蛋白在下列情况下会出现增加现象:- 胆管阻塞- 肾病综合征- 肝硬化- 缺铁性贫血- 血球蛋白异常- 高脂蛋白血症- 大量溶血 41 脂蛋白42酒精性肝硬化中的- 桥43444546出现在 b 区域的单克隆免疫球蛋白47游离轻链病48q在下列情况中会出现下降现象: - 部分的或全部的免疫缺陷- 免疫抑制治疗- 游离轻链病或非分泌型骨髓瘤49505152q多克隆免疫球蛋白的增加:- 炎症- 肝硬化- 亚急性和慢性感染q 检测到其他条带- 单克隆免疫球蛋白- 寡克隆免疫球蛋白

9、53高免疫球蛋白血症54血清蛋白021216狼疮病血清蛋白030127酒精肝B-r桥55微量单克隆免疫球蛋白56大量单克隆免疫球蛋白57双克隆免疫球蛋白58q与下列各类疾病相关的寡克隆免疫球蛋白(多个条带) :- 自身免疫病- 先天性免疫缺陷症- 病毒感染 (C Hepatitis, HIV disease, CMV(巨细胞病毒), EBV,)- 免疫抑制治疗59Oligoclonal pattern(寡克隆免疫球蛋白)60 血清蛋白电泳是 M蛋白 (Monoclonal Protein) 多克隆 (polyclonal Protein) 寡克隆 (Oligoclonal Protein) 的

10、首选检测项目61M蛋白疾病(Monoclonal gammapathies, MG)是由于单一克隆浆细胞无限增殖产生的均一单克隆蛋白(Monoclonal-proteins)所导致的一组疾病M蛋白疾病的“M”含义是Myeloma, Macroglobulinemia, Malignant lymphoma和Monoclonal Gammapathies均以“M”开头. M蛋白在电泳上表现为高而狭窄的尖峰.6263表表1 6461 646例例M M蛋白类型分类蛋白类型分类型别型别 例数例数 % %IgG型骨髓瘤 205 31.73IgA型骨髓瘤 93 14.40IgM型骨髓瘤 56 8.67Ig

11、D型骨髓瘤 12 1.86重链病 5 0.77轻链病 214 33.13半分子病 1 0.157S IgM 2 0.31BMG 49 7.59双M蛋白病 8 1.2464MM是造血系统的恶性肿瘤,占整个恶性肿瘤的1%常见于中、老年人(50-70岁居多,40岁以下少见).以往对此病认识不足，漏诊、误诊可达到70%以上.随着寿命的延长对此病认识的提高病例数显著增加.65骨痛,骨骼肿块与病理性骨折,骨质疏松和溶骨现象贫血免疫功能低下,反复感染肾脏损害高钙,高粘(血浆相对黏度6以上)高尿酸血症表现MMMM的临床表现多样化的临床表现多样化, ,常常因此就诊于常常因此就诊于骨科、肾脏内科等骨科、肾脏内科等

12、, ,延误诊治延误诊治66血中出现M蛋白,正常Ig水平明显减低尿中出现M蛋白和轻链蛋白(BJP)骨髓中浆细胞明显增加无免疫活性Ig导致免疫功能低下6768697071727374意义未明的单克隆免疫球蛋白疾病: Benign MC在法国,在对献血者进行检测时,会检测到0,15% 比例的单克隆免疫球蛋白携带者. 在老龄人群中检测到的携带者比例更高 (80岁以上人群). 在对60到99岁人群的检测显示, 出现Ig的比例从2,6%上升至19,2%.(平均值= 5%)MGUS75MGUS携带者特征:-未出现临床和影像学特征-未出现不良反应, 未检测到血钙升高,也未出现肾功 能衰竭-未见骨髓瘤的临床特征

13、-单克隆免疫球蛋白 20g/l -其他免疫球蛋白都是正常的,同时在患者尿液中未检测到本周氏蛋白-单克隆免疫球蛋白的浓度随着时间的推移未发生增 加现象-其他的免疫球蛋白的浓度也未随时间推移而出现下降 在在20%的情况中的情况中, MGUS 将会转化成恶性疾病将会转化成恶性疾病 (6-10 years)76MGUS的患者的 2035(average : 22 years)年的跟踪监测发现, 患者最终演变成恶性的淋巴细胞增生症(multiple myeloma, macroglobulinemia, amyloidosis,).从检测到单克隆免疫球蛋白,直到作出多发性骨髓瘤的诊断报告,这段时间是不定

14、的,从2-29年(平均是10年左右).77大量报告显示,在下列情况中,发展成为恶性淋巴细胞增生疾病的可能性很小 :- 单克隆免疫球蛋白: IgG 15 g/L IgA 10 g/L IgM 67kDa 67 kDa117118在 HYDRAGEL 5 PROTEINURIE 凝胶上 主要的尿蛋白的电泳条带区域分析起源于肾小管的各类蛋白(分子量 67 kDa)白蛋白(分子量 : 67 kDa)a1-微球蛋白 (MW : 33 kDa)游离轻链 (MW 25 kDa)转铁蛋白 (MW : 80 kDa)Cystatin (MW : 11 kDda)b2-微球蛋白 (MW :12 kDa)溶菌酶 (

15、MW : 15 kDa)视黄醇结合蛋白(MW : 21 kDa)游离轻链的二聚体(MW 50 kDa)Ig G (MW : 160 kDa)Ig A (MW : 165 kDa)结合珠蛋白加样位置a2-巨球蛋白 (MW :900 kDa)注 : (Cystatin C),血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂C119小分子蛋白, 分子量小于 67 kDa, 被过滤到尿液中.其他决定各种蛋白被过滤的因素 : 分析形状, 带电量, 血浆浓度.还有一些血液动力学因素可影响蛋白的过滤.120经常出现于成人及儿童患者中, 表现为尿蛋白含量出现增加现象 (大于1 g/24-h)原因 糖尿病 感染性损伤 (细菌感染, 乙

16、肝患者, 水痘, 梅毒, 单核白血球增多症 ,) 其他系统性疾病 (自动免疫系统, 癌症,) 中毒现象 (重金属, 药物中毒,)此时, 我们可以在尿蛋白中发现白蛋白和其他大分子量蛋白 (大于 67 kDa)。121122临床示例临床示例123在肾小球中被过滤掉的小分子蛋白， 分子量小于67 kDa, 将会在肾小管内被重新吸收 (内吞作用).99% 的在肾小球内被过滤的蛋白, 都将会被重新吸收利用. 例如, 18 g/24-h 白蛋白将会被过滤掉; 30 mg/L 白蛋白在人的尿液中被发现. 124肾小管损伤将会改变其对小蛋白分子的重新吸收能力 (小于67 kDa的蛋白)通常是暂时性的, 并且少

17、于0.5 g/24-hours原因 遗传原因 (Fanconis syndrome) 免疫球蛋白单克隆扩增 (骨髓瘤) 药物作用 (抗癌药物) 中毒现象 (重金属)白蛋白 ( 67 kDa 67 kDa 67 kDa127 67kDa6, the Bence Jones will interact strongly with the Tamm-Horsfall protein.- If the pI is low, there will be little interaction with THP. 轻链形成的聚合体: - (polymers can reach a MW of 900 kD)

18、. 轻链的初级结构: - The primary structure of the free light chains is also involved in the toxicity. This is due to the variable region of the light chain.139q当血液中检测到M蛋白时:- 进行24H尿蛋白检测- 电泳 + IF/BJ- 对异常峰进行鉴定- 对患者进行随访, 目的是确认药后疗效和肾脏损伤程度140原尿检测 (HR3 Program)141浓缩尿液检测 (HR2 Program)142Hydragel Bence Jones(本周氏蛋白检测

19、)143肾小管型损伤检测到:- 微量白蛋白, - 3 个肾小管型小分子蛋白- 多克隆的 k and l 型轻链,没有重链与之对应本周氏蛋白检测阴性144 总结145The Assay and the Clinical Application of Isoenzymes146同工酶是以多种分子形式存在于机体的催化功能相同分子结构不同147检测同工酶活力比单测定酶的总活力更具有脏器特异性和高灵敏性等优点, 因而提高了临床诊断价值早期诊断某些疾病, 阳性率高, 特异性强可以估计病情严重性和判断预后148国际化学联合会(International Union of pure and Applied C

20、hemistry IUPAC)建议:1、在命名同工酶时应采用规定的酶的名称2、如同工酶电泳图上各主要区带旁还分出若干亚区带时,可以用 a, b, c, d 注于主要区带的右下方.3、经明确鉴定过的特异同工酶, 可以附加诸如分子量, 稳定性,亚单位等参数.4、同工酶不应该用组织的分布来加以注解(如脑型，心肌型等)因为这类同工酶在别的生物机体中不一定存在于同一组织中。149乳酸脱氢酶同工酶(Lactate dehydrogenase, LDH)肌酸激酶同工酶(Creatine kinase, CK)碱性磷酸酶同工酶(Alkaline phosphatase, ALP)天冬氨酸氨基转移酶(Aspar

21、tate transaminase, AST) - 谷氨酰转移酶(- glutamyltransferase, GGT)a - 淀粉酶同工酶(a -Amylase, AMY)150由于同工酶的一级结构 (氨基酸序列)及高级结构(构象)的不同, 因此, 一种酶的各个同工酶在化学, 物理化学, 生物化学等方面的性质也就有所差异, 这些差异就提供了分析和鉴定同工酶的理论基础在研究同工酶的所有方法中，电泳法的使用最为广泛。因为此法简便、快速、分离效果良好，并且一般不会破坏酶的天然状态151乳酸脱氢酶是能催化乳酸脱氢生成丙酮酸的酶每种LD同功酶都是由4个亚单位(肽链)组成的四聚物. 这些亚单位中, 有两

22、类分别专属M(肌肉)和H(心脏).H4 = LD1H3M = LD2H2M2 = LD3HM3 = LD4M4 = LD5152组成与分布 LDH 15 H, M, MW 140,000.LDH 1,2: 心肌, 肾, 红细胞LDH 3: 肺, 脾, 胰, 甲状腺, 肾上腺, 淋巴结LDH 4,5: 骨骼肌, 肝LDH x: 睾丸, 精子检测方法-琼脂糖电泳法 原理: 以琼脂糖胶作为介质,LDH可分离出五种同工酶区带,根据其电泳迁移率的快慢, 将迁移最快的命名为 LDH1, 依次为 LDH2, LDH3, LDH4和LDH5,最后显色,扫描确定其百分率.参考值LDH1 28.4 5.3% LD

23、H2 41.0 5.0%LDH3 19.0 4.0% LDH4 6.6 3.5% LDH5 4.6 3.0%153154LDH1和LDH2升高： 见于急性心肌梗塞(LDH1LDH21)、病毒性心肌炎、风湿性心肌炎和克山病LDH5和LDH4升高： (1)急性肝炎：LDH5明显升高，LDH4轻度增高； (2)急性肝萎缩：LDH5和LDH4都明显升高； (3)慢性肝炎，肝硬化：LDH5轻度升高； (4)骨骼肌急性损伤、皮肌炎：LDH5和LDH4都升高； (5)前列腺癌：LDH5升高，LDH5LDH11LDH的五种同工酶都升高：见于胃癌、结肠癌和胰腺癌.155 肌酸激酶(CK)同工酶的组成 CK是由M

24、和B两种亚单位组成的二聚体,在细胞质内质内共有三种同工酶：CK-MM,CK-MB和CK-BB。在细胞线粒体内还有另一种同工酶，称为CK-Mt。这几种同工酶的分子量虽然相同，但免疫特性不同，电泳迁移率也不同。156Macro CKType ICK BBApplication point CK MBCK MMMacro CKType II脑组织及其它平滑肌 : CK-BB 0% 心肌细胞 : CK-MB 03%骨骼肌细胞 : CK-MM 97100% CK-MB的阳性决定水平为 5%1571581594小时小时20-30小时小时3-5天天1601-2小时小时12-20小时小时3天后天后1612神经

25、肌肉系统疾病神经肌肉系统疾病162巨CK1 是一种同工酶(抗体)与自身抗体的复合物最多的是CK-BB与IgG或IgA的复合物.也有少 数为CK-MM与IgG的复合物。CK-BB-IgG或IgA。老年人、风湿和心脏病、肌炎患者。在做冠脉造影的患者中巨CK1的发生率13.8，认为至少部分起源于血管壁。3例低血钾性肌病妇女。1例急性横纹肌溶解，肌肉内肉碱棕榈酰转移酶缺乏。认为巨CK1与自身免疫性疾病无明显联系。163巨CK2是一种低聚的线粒体 CK，又称 CK-Mt，存在于细胞线粒体膜上，当线粒体崩解时，线粒体的小碎片进入血液，使CK-Mt成低聚状态。众多文献认为巨CK2 不会在健康人血中出现，它与

26、恶性肿瘤密切相关，可作为肿瘤的标志物。原发性肺癌巨CK2检出率为56.8%。肺癌组CEA(人癌胚抗原)测定的阳性率40.0%。手术切除后巨CK2转为阴性，提示将巨CK2和CEA联合检测，用于检出肺癌有无周围淋巴结转移具有价值。巨CK2亦可为胃肠道恶性肿瘤的标志物，13例结肠癌患者，手术前有9例血清出现巨CK2；21例结肠癌或胃癌转移的患者中16例检出巨CK2。164MMMBBBMacro CK1165急性颅脑损伤患者血清CKBB监测的临床意义华西医学1997年12月2期何永生，叶长宁，四川省人民医院神经外科 目的；探讨急性颅脑损伤患者血清活性及动态变化的临床意义。方法：逐日监测例急性脑伤患者血

27、清活性，与临床指标对比评价其临床价值，并分析其变化规律与治疗转归，预后的关系，结果：血清在伤后早期升高，且与伤情成正比相关，较快恢复正常是治疗有效、无并发症和预后良好的标志。166急性颅脑损伤患者血清CKBB监测的临床意义华西医学1997年12月2期何永生，叶长宁，四川省人民医院神经外科 目的目的：探讨急性颅脑损伤患者血清活性及动态变化的临床意义。方法：方法：逐日监测例急性脑伤患者血清活性，与临床指标对比评价其临床价值，并分析其变化规律与治疗转归，预后的关系，结果：结果：血清在伤后早期升高，且与伤情成正比相关，较快恢复正常是治疗有效、无并发症和预后良好的标志。167动态监测缺氧缺血性脑病患儿血

28、清CK-BB的临床意义中国误诊学杂志2002年 第2卷第12期郑红英 目的：目的：探讨缺氧缺血性脑病(HIE)新生儿血清脑型肌酸激酶同工酶(CK-BB)和心型肌酸激酶同工酶(CK-MB)的活性变化,以了解CK-BB和CK-MB对HIE患儿的检测价值.方法：方法：在出生后13 d检测HIE患儿CK、CK-BB、CK-MB活性,与正常新生儿作对比,分析各项指标与病情、转归、预后的关系.结果：结果：中度、重度HIE患儿血清CK-BB、CK与正常新生儿相比有显著性升高;重度组CK-MB比正常组显著升高.CK-BB活性迅速下降者,治疗有效,预后良好;CK-BB活力持续升高,患儿预后差, CK-MB升高患

29、儿常伴有心肌功能损害.结论：结论：血清CK-BB是诊断HIE的可靠、特异性指标,动态监测新生儿CK-BB、CK-MB活性对病情估计、判断疗效及预后评估有重要价值. 168当代医学，2007年6月傅发展，浙江省蒲江县人民医院目的目的 探讨羊水混浊新生儿肌酸磷酸激酶及其同功酶的改变及意义。方法方法 24例羊水混浊新生儿暂无心脑肺等脏器并发症作为实验组，24例正常新生儿作为对照组，出生后48小时内测定CK、CK-MB、CK-BB。 结果结果 两组差异有显著性（P0.01）。 结论结论 CK-BB主要存在于脑部神经细胞和星形胶质细胞的胞浆中，只有在神经元和胶质细胞受损时才释放到细胞外。由于宫内缺氧导致

30、血脑屏障功能受损，因而大量CK-BB通过血脑屏障进入血液循环，使血清中水平升高。CK-BB在血中表达水平越高，持续时间越长，表明脑损害病情越重，因其有较高的特异性与灵敏性，在脑缺氧损害时，CK-BB可作为早期诊断、病情估计及判断预后的评价指标。 169中国优生与遗传杂志，2006年第14卷05期张爱梅, 刘长云, 吕祖芳, 段全纪目的：目的：探讨新生儿血清肌酸激酶脑型同工酶(CK-BB)的水平与脑实质CT值对缺氧缺血 性脑病(HIE)的诊断价值.方法：方法：采用比色法对49例HIE患儿和32例对照组新生儿血清CK-BB水平进行动态测定. 同时采用日本东芝Aqilion 螺旋CT扫描机单纯头颅平

31、扫,在CT诊断分度的同时测 定脑实质CT值.结果：结果：生后24小时内HIE组血清CK-BB水平与对照组相比明显增高(P均0.01), 且 HIE各组之间差异有显著性意义(P均0.01);生后48及72小时重度HIE组血清 CK-BB水平仍高于对照组(P 0.01),与轻、中度HIE组与对照组相比差异有非 常显著性意义(P 0.01).轻、中、重度HIE患儿脑实质CT值均明显低于对照组 (均P 0.01),且HIE各组之间差异有显著性意义(P均0.01).相关分析发现, HIE组生后24小时内患儿血清CK-BB水平与脑实质CT值呈显著负相关(r =- 0.747, P 0.01).结论：结论：

32、血清CK-BB水平监测可作为HIE诊断及评价脑损伤程度的早期预测指标, 与脑实质CT值结合可对窒息后缺氧缺血性脑病做出早期而正确的诊断,为早期治 疗提供依据. 170171中枢合成免疫球蛋白是中枢神经系统疾患的一个重要信号，主要用于对中枢神经系统疾患进行诊断和鉴别诊断如：多发性硬化症、痴呆、脊髓炎、副肿瘤性脑炎、神经性梅毒等现阶段临床上诊断中枢神经系统病变主要依靠影像学结合临床分析，但是，在病变早期影像学及常规检查常无法诊断然而中枢神经系统病变患者脑脊液中免疫球蛋白IgG增加却发生较早发生较早因此实验中对脑脊液中IgG进行蛋白电泳，形成的典型寡克隆区带对上述疾病的早期诊断而言，是重要的、必不可少的重要的、必不可少的依据172利用高分辨技术在琼脂糖凝胶上对脑脊液蛋白进行电泳分离(血清中的免疫球蛋白的浓度应该被稀释到和脑脊液中Ig一样的浓度: 5 至 10 mg/L).利用与标有过氧化氢酶的特异的抗血清(G, A, M, k, l)之间的免疫反应,免疫球蛋白将会被固定在Igs过氧化氢酶被激活