恶性疟复合多价抗原基因在小鼠中免疫应答的初步研究

1、恶性疟复合多价抗原基因在小鼠中免疫应答的初步研究    黄建生张丽芸郭明秋王昌才任大明 【摘要】目的探索恶性疟复合多价DNA疫苗的可行性。方法把带有ATG的接头与人工合成的恶性疟原虫复合多价抗原基因AB相连后，构建分别带有SV40或RSV启动子的真核表达载体pSV2/AB及pREP9/AB,重组表达质粒经肌肉注射免疫BALB/c小鼠后，检测其诱发特异性体液和细胞免疫应答水平及毒副作用。结果pSV2/AB及pREP9/AB免疫BALB/c小鼠后均诱发了一定水平的细胞及体液免疫应答,带RSV启动子的pREP9/AB免疫原性略强于带SV40启动子的pSV2/A

2、B, DNA免疫后未见明显的毒副作用。 结论恶性疟复合多价DNA疫苗可诱发特异的免疫应答,为疟疾DNA疫苗的研究提供了一定的理论及实验依据。 【主题词】DNA疫苗疟原虫，恶性复合多价基因 Immunogenicity of multivalent antigen gene of Plasmodium falciparum in BALB/c mice Huang Jiansheng, Zhang Liyun, Guo Mingqiu,et al.Institute of Genetics,Fudan University, Shanghai 200433 【Abstract】Objective

3、To study the possibility of multivalent DNA vaccine of P. falciparum. MethodsA multivalent gene AB of P. falciparum was ligated with a 18bp linker,then cloned into the eukaryotic vectors pSV2-neo or pREP9,which possessed SV40 or RSV promoter respectively.The recombinant plasmids pSV2/AB and pREP9/AB

4、 were then intramuscularly injected to BALB/c mice, and the specific humoral and cellular immunity and its side-effects were tested. ResultsThe two recombinant plasmids DNA could induce specific immune reactions without obvious toxicity,which showed that the immunogenicity of pREP9/AB was better tha

5、n that of pSV2/AB. Conclusions The multivalent DNA vaccine of P. falciparum could induce specific immune reactions,which might have provided some new experimental data for the further research of malaria vaccines. 【Subject words】DNA vaccinePlasmodium falciparumMultivalent gene DNA疫苗兼有亚单位疫苗的安全性及减毒活疫苗

6、诱导全面免疫应答的高效性，为亚单位疫苗的研究提供了一条崭新的途径，已成为疫苗研究的热点之一1。我们根据Patarroyo等报道的恶性疟原虫复合SPf66及SPf105多肽序列，人工合成的复合多价抗原基因AB已经在大肠杆菌及减毒鼠伤寒沙门氏菌中获得高效表达2，3。现把该基因重组到真核表达载体pSV 2-neo(带SV40启动子)及pREP9(带RSV启动子)中，构建pSV2/AB及pREP9/AB重组表达载体，并研究恶性疟复合多价抗原基因在小鼠中的免疫应答情况。 材料与方法 1. 菌株与质粒:E.coli TG1 为复旦大学遗传学研究所国家重点实验室保存菌种，质粒pWRAB、pWR450-1、p

7、SV2-neo及pREP9为第一军医大学分子生物学研究所提供。 2. 酶:限制性内切酶、T4 DNA连接酶、T4多核苷酸激酶均购自Promega公司。 3. 接头:带有ATG的18bp接头为中山医科大学基因诊断中心所合成，序列为: HindEcoRSal 5' AGCTTATGGAATTCATGG 3' 3' ATACCTTAAGTACCAGCT 5' 4. 接头与AB基因的串联:见图1。 图1 pSV2/AB及pREP9/AB真核表达载体构建策略图 Fig1. Cloning strategy of eukaryotic expression vectors

8、pSV2/AB and pREP9/AB 5. 序列分析及酶切鉴定:用Hind/BamH从pWRAB-1中切下带有接头的AB片段，克隆到pUC18中，进行PCR自动测序。 小量抽提质粒pREP9/AB 及pSV2/AB，其中pREP9/AB经Hind/ BamH双酶切，8.0% PAGE鉴定; pSV2/AB经EcoR酶切后，1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定。 6.小鼠免疫:按常规方法大量抽提质粒pSV2/AB、pREP9/AB、pSV2-neo及pREP9。健康雄性BALB/c小鼠，8周龄，1922g/只，每组5只。 DNA溶液注射于小鼠右下肢股四头肌，注射量均为100g/只。实验共分为pSV2/

9、AB组、pSV2组、pREP9/AB组、pREP9组及空白对照组(注射100l ddH2O/只)。 7. ELISA法检测特异性抗体:参照文献4，5进行, GZ-AB抗原的纯化如前所述4。 免疫0周开始自小鼠尾静脉采血约50l,分离血清,隔周采血一次。鼠抗血清自1100始倍比稀释。HRP-兔抗鼠IgG购自华美生物工程公司，12000稀释。阳性对照抗恶性疟原虫血清为第一军医大学分子生物学研究所制备。 8. 迟发性超敏反应(DTH):参照文献4进行，皮下注射抗原GZ-AB 1.0g/只，观察注射部位变化。 9. 安全性:观察注射部位变化，小鼠行为、食欲及体重等。免疫后8周，部分小鼠，作大体解剖。

10、结果 1. 序列分析和质粒酶切电泳及结果:克隆在pUC18带接头的AB片段, 经PCR测序证实与设计的一致(结果未显示) , 保证了所克隆基因读框的正确性。 pSV2/AB经EcoR酶切后，切出了约2.6kb及3.4kb的两条目的条带(见图2), 这是由于在接头的5'端设计了一个EcoRI位点, 使pSV2/AB质粒上有两个EcoR位点; pREP9/AB经Hind/BamH酶切后，切出了约360bp的AB片段, 大小正确3。 图2 pSV2/AB经EcoRI酶切的1.0%琼脂糖电泳图谱 Fig2. pSV2/AB digested with EcoRI (1.0% agarose)

11、1 pSV2 plasmid; 2 pSV2 EcoRI; 3,4 pSV2/AB EcoRI; 5 DNA Hind 2. ELISA结果:ELISA结果用其滴度的倒数表示(见图3); pSV2、pREP9及空白对照组抗体滴度均小于1100(未列出)。 图3 ELISA测定复合多价DNA疫苗诱发特异性抗体结果 Fig3. Specific antibodies induced by multivalent DNA vaccine of P. falciparum detected by ELISA 3. DTH结果:疫苗组小鼠皮下注射GZ-AB抗原后第二天，可见注射部位出现红、肿、局部发热等

12、明显的DTH反应体征，见表1: 表1 恶性疟复合多价DNA疫苗诱发DTH结果 Table1. Results of DTH reactioninduced by multivalent DNA vaccines of P.faciparum Group 1d 2d 3d pSV2/AB + + +/- pSV2 - - -      pREP9/AB + + + pREP9 +/- - - Control - - - 4. 安全性: 小鼠免疫后注射部位未见明显异常体征，食欲正常，未见消瘦，各组体重于免疫后第4周及第8周未见显著差异。解剖未见小鼠肝及淋巴结

13、明显肿大，但pSV2/AB及pREP9/AB疫苗组小鼠脾脏轻度肿大。 讨论 DNA疫苗又称核酸疫苗，其作用机理与普通疫苗有所不同，外源DNA免疫后可在宿主细胞(主要为肌细胞)表达目的蛋白质，经加工处理后与MHC-类分子形成复合物，并提呈到细胞表面，由CTL细胞识别发挥其杀伤作用。有些疾病的DNA疫苗动物实验已取得可喜的结果68。其最大优点就是可为变异迅速的病原微生物提供交叉防御作用；而且外源DNA不与宿主染色体DNA整合，本身不复制，但能持续在宿主细胞中存在，表达所编码的目的蛋白质。因此，对于高度变异的疟原虫的防治，DNA疫苗是值得探讨的途径之一。 我们构建的恶性疟复合多价DNA真核表达载体p

14、SV2/AB及pREP9/AB，重组DNA质粒经肌肉注射免疫BALB/c小鼠后，无论是体液免疫还是细胞免疫，pREP9/AB都诱发了比pSV2/AB更强的免疫应答，这可能与启动子RSV更强有关。DNA疫苗在注射后56周抗体滴度达到最高，这与一般抗原的免疫应答有所差异，可能与外源DNA需在肌肉细胞中先表达出足够多的目的抗原后，才能诱发有效的免疫应答有关。 恶性疟DNA疫苗经免疫小鼠后，能诱导产生特异性抗体无不良反应，为疟疾DNA疫苗的研究提供了一定的实验基础。由于动物模型的限制(小鼠非恶性疟动物模型),这些DNA疫苗作用的长期性、保护性及外源DNA能否与染色体DNA整合等，则需进一步研究。 作者

15、单位: 200433 上海, 复旦大学遗传学研究所遗传工程国家重点实验室(黄建生，任大明); 第一军医大学免疫学教研室(黄建生，张丽芸，郭明秋); 第一军医大学分子生物学研究所(王昌才) 参考文献 1Roberson A. DNA-based vaccines:new possibilities for disease prevention and treatment. Can Med Assoc J, 1995;152(10)1629-1632. 2王昌才,钟雄林,陈仕荣,等. 恶性疟原虫杂合抗原基因的表达及其产物免疫功能的研究.上海免疫学杂志，1997，17(3)139-142. 3黄建生

16、,王昌才,任大明,等. 恶性疟原虫杂合113肽抗原基因在减毒鼠伤寒沙门氏菌SL3261中的表达. 中国寄生虫病防治杂志, 1995;8(3)173-177. 4黄建生,王昌才,任大明. 恶性疟原虫杂合45肽抗原基因在BALB/c小鼠中免疫应答的研究. 中国人兽共患病杂志, 1995;11(4)19-23. 5Huang JS,Wang CC,Ren DM, et al. Immunogenicity of recombinant attenuated S. typhimurium expressing a 45-peptide hybrid antigen gene of P. falciparum. J Med Col PLA1997;12(2)169-173. 6Lu S,Santoro JC,Fuller DH, et al. Use of DNAs expressing HIV-1 Env and noninfectous HIV-1 particles to raise antibody responses in mice. Virology,1995;209(1)147-153. 7Lagging LM,Meyer K,Hoft B, et al.Immune response to DNA