分子生物学实验基础4h

1、 罗建新第一章 序论 第一节 概述分子诊断学的形成在分子生物学及生物化学基础上发展起来的，以研究核酸和蛋白质结构、功能等生命本质的学科，在核酸、蛋白质分子水平研究疾病的发病、诊断、治疗和预后的机制。其中基因工程是目前分子生物学研究的热点之一，这些技术可以改造或扩增基因和基因产物，使微量的研究对象达到分析水平，是研究基因表达和调控的方法，也是在分子水平研究疾病发生机制、基因诊断和基因治疗的方法。 主要内容1.内源基因异常的检验和诊断自身基因结构异常 基因功能异常表达产物蛋白质结构功能异常 致病基因调控异常 致病如 肿瘤 遗传病2.外源基因侵入体内检测及诊断病原微生物 B ,V 依核心部分基因DN

2、A, RNA不同检测及病原学分类如 HBV HIV等核酸是生命的存在形式蛋白质是生命表现形式3. 分子诊断学与以往医学诊断的关系DNARNA临床表现蛋白质转录逆转录翻译基因诊断生化检验临床诊断HGP完成完成第二节 分子生物学实验基础 一、基本概念核酸（ ）结构 理化性质复性 变性 Tm值蛋白质结构 理化性质 基因重组(Genetic recombination) 基因重组是自然界常见到现象，指的是整段DNA在细胞内或细胞间、甚至在不同物种之间进行交换，并能在新的位置上复制、转录和翻译。 它在进化、繁殖、病毒感染、基因表达以及癌基因激活等过程中起着重要作用。也可以认为是一种自然突变现象。 基因重

3、组的方式转化(Transformation) 外来基因引起细胞生物性状改变的过程或将质粒或以质粒为载体的重组DNA分子导入受体细胞的过程。 转染（Transfection） 以噬菌体或病毒或以之为载体所构建的重组DNA分子导入宿主细胞的过程。 转导（Transduction） 利用载体把遗传物质从一种宿主传给另一宿主的过程。转位（Transposition） 一个或一组基因从一处转移到基因组的另一位 置 的 过 程 ， 这 些 游 动 的 基 因 称 为 转 位 子(Transposon)。 遗传工程遗传工程广义广义: 整体水平整体水平 细胞水平细胞水平 染色体水平染色体水平 分子水平分子水平

4、狭义狭义: 指分子水平指分子水平 基因工程基因工程 基因克隆基因克隆 DNA克隆克隆 重组重组DNA技术相关概念技术相关概念 DNA克隆克隆克隆（克隆（clone）：）： 来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。克隆化（克隆化（cloning）：）： 获取同一拷贝的过程，即无性繁殖。获取同一拷贝的过程，即无性繁殖。分子克隆（分子克隆（DNA克隆）克隆）细胞克隆细胞克隆个体克隆（动物或植物）个体克隆（动物或植物）基因工程（Gene engineering） 定义定义 指在体外将外源核酸分子插入质粒、病毒或指在体外将外源核酸分子插入质粒、病毒或其它载体分子，构成遗传

5、物质的新组合，并使之其它载体分子，构成遗传物质的新组合，并使之参入到原先没有这类分子的寄主细胞内，并且能参入到原先没有这类分子的寄主细胞内，并且能持续稳定地繁殖。持续稳定地繁殖。v 基因克隆（Gene cloning）v 体外重组DNA技术（in vitro recombinant DNA technology）DNA克隆：克隆： 应用酶学的方法，在体外将各种来源的应用酶学的方法，在体外将各种来源的 DNA与载体与载体DNA结合成具有自我复制能力的结合成具有自我复制能力的 DNA分子，继而通过转化或转染宿主细胞，分子，继而通过转化或转染宿主细胞， 筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行筛选出含

6、有目的基因的转化子细胞，再进行 扩增、提取获得大量同一扩增、提取获得大量同一DNA分子。又称基分子。又称基 因克隆或重组因克隆或重组DNA。1972年 P.Berg etc首次用EcoRI切.接SV40和phageDNA构建第一个人工DNA分子.获1981年诺贝尔化学奖1973年 Cohens.etc用 EcoRI 切.体外连接质粒Tc-pSC101和 Neo-R6-5导入大肠杆菌,使其具有四环素和新酶素抗性.完成第一分子克隆全过程. 重组重组DNADNA技术基本原理技术基本原理分离纯化或人工合成带有目的基因的DNA片段； 在体外将目的基因与载体DNA结合，成为重组 DNA分子； 将重组DNA

7、导入到适当的受体细胞，并与之一起增殖；同时筛选出带有重组DNA分子的受体细胞克隆； 从筛选出来的受体细胞克隆中，提取目的基因供进一步分析研究使用； 将目的基因克隆到表达载体并导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下，实现功能表达。二、基因工程的常用工具、基因工程的常用工具1. 定义 指能把外源DNA（目的基因）导入宿主细胞，并使之传代、扩增、表达的工具。 （一）载体（Vector） 能够独立自主的复制，且目的基因的插入不影 响载体的复制能力； 具有至少一个单一酶切位点； 具有显著的遗传标记，便于筛选； 供插入外源基因的片段范围大，且能稳定存在； 载体本身分子量小，拷贝量高； 安全。 2. 条件按来源

8、分v 质粒（plasmid）v 噬菌体（phage） 病毒（virus） 3.分类按用途分v 克隆载体 表达载体4、质粒(1)定义 是一种存在于细菌中，独立于细菌染色体之外的遗传因子，能够自主稳定独立复制的共价闭环的双链DNA，一般对细菌的生存无影响。 (2)分类：根据拷贝数可将质粒分成两种不同的复制型 “严紧型”质粒（stringent plasmid） “松弛型”质粒（relaxed plasmid）(3)命名命名 eg：pBR322“P”-表示是一种质粒plasmid“BR”-分别取自该质粒的两位主要构建者 F.Bolivar和R.L.Rodriguez姓氏的第一个 字母 322-指实验

9、编号，以与其它质粒载体如： PBR325、PBR327等相区别(4)举例举例 pBV220 优点： 1. 个体较小（几个kb），易于获得； 2. 含有显著的遗传标记通常有2个以上； 3. 拷贝数高； 4. 易于导入外源基因，易于进入宿主细 胞并稳定存在； 缺点：可插入的外源片段小10kb以下。特点5、噬菌体载体、噬菌体载体 噬菌体及其衍生物 单链噬菌体M13 粘尾质粒（cosmid）等 猴多瘤病毒40（SV40） 腺病毒 逆转录病毒等 6、病毒载体、病毒载体. .噬菌体（噬菌体（phagephage）DNADNA 噬菌体噬菌体DNADNA改造系统改造系统 gt gt 系列（插入型，适用系列（插

10、入型，适用cDNAcDNA克隆）克隆） EMBLEMBL系列（置换型，适用基因组克隆）系列（置换型，适用基因组克隆）M13M13噬菌体噬菌体DNADNA改造系统改造系统（含（含lac Zlac Z基因）基因） M13mpM13mp系列系列 pUCpUC系列系列 柯斯质粒（柯斯质粒（cosmid）酵母人工染色体载体酵母人工染色体载体 （yeast artificial chromosome, YAC）细菌人工染色体细菌人工染色体 （bacterial artificial chromosome, BAC）动物病毒动物病毒DNA改造的载体改造的载体 （如腺病毒、腺病毒相关病毒、逆转录（如腺病毒、腺

11、病毒相关病毒、逆转录病毒）病毒）（二）工具酶 基因的分离和重组，涉及到一系列相互关联的酶促反应，已知道有许多重要的核酸酶（如限制性核酸内切酶、连接酶、聚合酶、末端转移酶等等）在基因克隆实验中有着广泛的用途。而其中限制性核酸内切酶和连接酶的发现和应用，才真正使DNA分子的体外切割与连接成为可能，是DNA重组技术赖以创立的重要酶学基础。1、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease） 定义 是一类能识别双链DNA分子中某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。常形象地称之为核酸分子的“手术刀” 。命名 eg：EcoRI 、Hind 分型 识别识别DNA的特异

12、序列，并在识别位的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。的一类内切酶。 是细菌内存在的保护性酶。分为是细菌内存在的保护性酶。分为I、II、III三类。三类。II类酶识别序列特点为类酶识别序列特点为回文结构回文结构。 GGATCC CCTAGG 特性 型 型 型限制和修饰活性 同时具有内切酶、 核酸内切酶 类似I，多功能酶 甲基化酶活性 酶的蛋白结构 3种不同的亚基 单一的成分 2种不同的亚基 所需的辅助因子 ATP、Mg2 、 Mg2 ATP、Mg2 、 S-腺苷甲硫氨酸 S-腺苷甲硫氨酸切割位点 在距特异性位点至少 位于特异性位点 距特异性位点3端 10

13、00bp的地方可能随 或其附近 2426bp处 机地切割 序列特异的切割 否 是 是在DNA克隆中的 无用 十分有用 用处不大 用处 核酸内切限制酶的类型及其主要特性 活性单位 在一定的反应条件下（pH、温度、离子浓度等）和时间内(60分钟)能够完全酶解1g的DNA分子底物所需的酶量 识别、切割序列 能识别由48个核苷酸组成的特定的核苷酸序列（称为核酸内切限制酶的识别序列） 两条链上的断裂位置是交错的、但又是对称地围绕着一个对称轴排列，形成所谓粘性末端DNA片段 EcoRI 5GAATT C3 5G AATTC3 3C TTAAG5 3C TTAA G5 PstI 5C TGCAG3 5C T

14、GCA G3 3GACGT C5 3G ACGTC5 断裂类型 两条链的断裂位置是处在一个对称结构的中心，形成平末端的DNA片段。 Hae 5G-GC-C3 5G-G 3 5 C-C3 3C-CG-G5 3C-C 3 5 G-G5 5 -端突出端突出粘性末端粘性末端 3 -端突出端突出限制性核酸内切酶识别序列长度为限制性核酸内切酶识别序列长度为48个个bp。不同酶切产生的相同粘性末端称不同酶切产生的相同粘性末端称配伍配伍末端末端（compatible end），），可用连接酶连接。可用连接酶连接。限制性核酸内切酶作用后产生两种末端：限制性核酸内切酶作用后产生两种末端： 钝性末端钝性末端( (b

15、lunt end) blunt end) 粘性末端粘性末端( (sticky end)sticky end)Hind IIIBamH IGCCTAGGATCCG+GTCCAGGACCTG+GTCGACCAGCTGGGATCCCCTAGG星号活力（star activity） 在一些非标准反应条件下，限制性核酸内切酶能够识别和切割与其特异性识别序列相类似的序列，使切割的特异性下降。 导致星号活力的产生因素v 高浓度的限制性核酸内切酶； v 高浓度的甘油； v 低离子强度； v 用Mn2取代Mg2以及高pH值等等；2.核酸修饰酶核酸修饰酶(1)连接酶连接酶(2)聚合酶 三三.目的基因目的基因应用重

16、组应用重组DNA技术所要分离、获得的基因技术所要分离、获得的基因(已知已知及未知及未知)1. cDNA(complementary DNA):是指经反转是指经反转 录合成的，与录合成的，与RNA互补的单链互补的单链DNA。以单链以单链cDNA为模板，经聚合反应可合成双链为模板，经聚合反应可合成双链cDNA。2. 基因组基因组DNA（genomic DNA）：）：是指代是指代 表一个细胞或生物体整套遗传信息（染色体表一个细胞或生物体整套遗传信息（染色体及线粒体）的所有及线粒体）的所有DNA序列。序列。 目的基因的获取目的基因的获取1.化学合成法化学合成法用于已知序列，或可推导出序列的基因用于已知

17、序列，或可推导出序列的基因2.基因组基因组DNA基因组基因组DNA文库（文库（genomic DNA library）3.cDNAcDNA文库（文库（cDNA library）4.聚合酶链反应（聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）基因组基因组DNADNA文库文库存在于转化细菌内，存在于转化细菌内，由克隆载体所携带的所由克隆载体所携带的所有基因组有基因组DNADNA的集合。的集合。简称简称G G文库。文库。组组织织或或细细胞胞染染色色体体D DN NA A限制性内切酶基因片段克隆载体重重组组D DN NA A分分子子受体菌含重组分子的转化菌 cDNAcDN

18、A文库文库用细胞总用细胞总mRNAmRNA制备全套双链制备全套双链cDNAcDNA后，后，建立的基因文库。简称建立的基因文库。简称c c文库。文库。mRNA逆转录酶cDNA复制双双链链c cD DN NA A载体重重组组D DN NA A分分子子受体菌含重组分子的转化菌 四四.基因克隆的全过程基因克隆的全过程 (一一) 制备目的基因制备目的基因（二）克隆载体的选择（二）克隆载体的选择 （三）外源基因与载体的连接（三）外源基因与载体的连接1. 粘性末端连接粘性末端连接GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCGGCCTAGGATCCGD DN NA A连连接接酶酶GC

19、CTAGGATCCG 2. 平端连接平端连接限制性内切酶作用产生的平端限制性内切酶作用产生的平端粘端经特殊酶处理变为平端粘端经特殊酶处理变为平端3. 同聚物加尾连接同聚物加尾连接 由末端转移酶作用，在由末端转移酶作用，在DNADNA片段末端加片段末端加 上同聚物序列，制造出粘性末端再连接。上同聚物序列，制造出粘性末端再连接。4. 人工接头人工接头 由平端加上带有新的酶切位点的寡核苷由平端加上带有新的酶切位点的寡核苷 酸，再用限制酶切产生粘性末端，进行连接。酸，再用限制酶切产生粘性末端，进行连接。 （四）重组（四）重组DNA导入受体菌导入受体菌受体菌条件：受体菌条件：安全宿主菌安全宿主菌 限制酶

20、和重组酶缺陷限制酶和重组酶缺陷 处于感受态处于感受态导入方式：导入方式：转化转化(transformation) 转染（转染（transfaction） 感染（感染（infection） （五）重组体的筛选（五）重组体的筛选重组重组DNA导入受体菌后，经过培导入受体菌后，经过培养使其大量繁殖，再设法将含有目的养使其大量繁殖，再设法将含有目的基因的菌落区分鉴定出来，这一过程基因的菌落区分鉴定出来，这一过程即为筛选（即为筛选（screening）或选择或选择（selection）。）。 1. 直接选择法：直接选择法：针对载体携带某种或某些标志基因针对载体携带某种或某些标志基因 和目的基因而设计的筛

21、选方法。其特和目的基因而设计的筛选方法。其特 点是直接测定基因或基因表型。点是直接测定基因或基因表型。 抗药性标记选择（插入失活法）：抗药性标记选择（插入失活法）： 将目的基因插入带将目的基因插入带ampampr r和和tettetr r基因载基因载体的体的tettetr r基因中，则基因中，则tettetr r基因失活。在分别基因失活。在分别含有氨苄青霉素和含四环素的两个培养基中含有氨苄青霉素和含四环素的两个培养基中培养，进行筛选。培养，进行筛选。 标志补救（标志补救（marker rescue）若目的基因能够在宿主菌表达，且表达若目的基因能够在宿主菌表达，且表达 产物与宿主菌的营养缺陷互补

22、，就可利用对产物与宿主菌的营养缺陷互补，就可利用对 营养素的依赖表型来筛选。营养素的依赖表型来筛选。 分子杂交法：分子杂交法：利用利用3232P P标记的探针与转移至硝酸纤维素标记的探针与转移至硝酸纤维素 膜上的转化子膜上的转化子DNADNA或克隆的或克隆的DNADNA片段进行分子片段进行分子 杂交，直接选择并鉴定目的基因。杂交，直接选择并鉴定目的基因。 原位杂交原位杂交 SouthernSouthern印迹印迹 2.2. 非直接选择法：非直接选择法：免疫学方法：利用特异抗体与目的免疫学方法：利用特异抗体与目的 基因表达产物相互作用进行筛选。包括：基因表达产物相互作用进行筛选。包括：免疫化学方法免疫化学方法酶免检测法酶免检测法 （六）克隆基因的表达（