祛痰散瘀软坚中药对肺纤维化大鼠肺组织病理形态学及HYP含量的影

1、祛痰散瘀软坚中药对肺纤维化大鼠肺组织病理形态学及HYP含量的影         【摘要】 目的观察祛痰散瘀软坚中药对肺纤维化大鼠肺组织病理形态学及HYP（羟脯氨酸）含量的影响。方法大鼠气管内注入博莱霉素建立肺纤维化模型。随机分为正常对照组、模型组、中药高剂量组、中药低剂量组和强的松组。造模次日每天按剂量给药，分别在第7、28天        【摘要】  目的观察祛痰散瘀软坚中药对肺纤维化大鼠肺组织病理形态学及HYP（羟脯氨酸）

2、含量的影响。方法大鼠气管内注入博莱霉素建立肺纤维化模型。随机分为正常对照组、模型组、中药高剂量组、中药低剂量组和强的松组。造模次日每天按剂量给药，分别在第7、28天分批次处死动物，制作病理标本，观察肺组织病理形态学变化及计算肺组织HYP含量。结果模型组7d时肺泡腔内大量炎性细胞浸润，可见少量成纤维细胞，I型细胞受损，II型细胞明显增生；28d时肺泡炎减轻，肺间质和胸膜层胶原纤维明显增多。各治疗组7d时炎性细胞浸润较模型组少，肺组织结构较模型组完整，28d时肺泡间隔增厚及间质内成纤维细胞增殖较模型组减轻，电镜下观察亦如此。28d时各治疗组的肺组织HYP含量均低于模型组（P<0.01或P&l

3、t;0.05）。结论除痰散瘀软坚中药能有效抑制博莱霉素引起的肺纤维化形成。 【关键词】  肺纤维化 羟脯氨酸 祛痰 散瘀 软坚肺纤维化是一种以两肺间质纤维化伴蜂窝状改变为特征的疾病。近年来中药防治肺纤维化的研究成为肺科学界关注的焦点，以期寻找更安全、有效的药物治疗本病。本研究采用博莱霉素A5(BLMA5)建立大鼠肺纤维化模型，观察祛痰、散瘀软坚中药对肺纤维化大鼠病理形态学和肺组织羟脯氨酸(HYP)含量的影响，探讨其对肺纤维化的治疗作用。1  材料与方法1.1  动物、药品及主要试剂  SD大鼠80只，体重，由浙江中医药大学动物实验中心提供。批号：ScxK

4、（沪）20040003。复方中药由苏木12g，皂角刺9g，鬼见羽15g等组成，按比例常规水煎，60%醇沉后浓缩为含生药1.82g/ml。所用中药购于浙江省中医院中药房，由中药制剂室制备。博莱霉素A5由天津太和制药有限公司生产，批号 040310。强的松（泼尼松）片剂由浙江仙居制药厂生产，批号040406。对二氨基苯甲酸由天津化学试剂研究所提供，批号020801。 L羟脯氨酸标准品由中国科学院上海生物化学厂提供，批号011207。1.2  动物造模  80只健康SD大鼠，随机选取16只为正常对照组（组），余64只为模型动物，参照文献方法2将所有大鼠用硫喷妥钠（剂量为3mg/1

5、00g体重）腹腔麻醉后，仰卧位固定于手术台上，暴露喉头，额镜直视下趁动物吸气瞬间，将与注射器相连的7号钝头腰穿针插入气管内，模型动物注入BLMA5（剂量为2ml/kg体重），并注入0.2ml空气，完毕后迅速将动物直立、顺时针旋转，动物清醒后随意进食。1.3  分组与给药  造模结束后，随机将64只模型动物分为模型组、中药高剂量组（组）、中药低剂量组、强的松组，每组各16只。正常对照组与模型组每天灌服无菌生理盐水1ml/100g体重，1日2次；强的松组每天给予强的松0.6mg/100g体重灌胃（使用时将强的松片剂碾碎，加2ml无菌生理盐水稀释），1日1次，顿服；中药高剂量组每

6、天给予中药1.1ml/100g体重灌胃，1日2次；低剂量组每天给予中药0.55ml/100g体重灌胃，灌胃时加适量生理盐水，稀释至与高剂量组相同的灌胃量，1日2次；以上均喂服28d。1.4  标本采集  分别于第7、28天放血，分批处死动物（每批每组8只）后，迅速开胸，取出心肺，制作病理标本和进行生化检查。分离出肺，夹闭右主支气管，10%福尔马林溶液经左支气管灌注固定30min后，投入10%福尔马林溶液中固定24h，石蜡包埋，常规切片，分别行HE及Masson染色，观察肺泡炎及肺纤维化程序。迅速从右肺切1mm×1mm×1mm组织两块，以冷却2.5%戊二醛

7、进行固定8h后，PBS（PH7.4、0.2mol/L磷酸缓冲液）冲洗，钌红水固定24h，常规切片，进行电镜观察。1.5  形态学分级  根据Szapiel3等方法确定肺泡炎及肺纤维化的程度。利用HE染色的病理切片将肺泡炎分为4级：0级：无肺泡炎（）；1级：轻度肺泡炎（+），肺泡膈因细胞浸润增宽，病变范围局限在全肺的20%以下；2级：中度肺泡炎（+），病变范围占全肺的20%50%；3级：重度肺泡炎（+），呈弥漫性分布，病变范围大于50%。利用Masson染色的切片将肺间质纤维化分为4级：0级：无间质纤维化（）；1级：轻度间质纤维化（+），病变范围局限在全肺的20%以下；2级；

8、中度肺间质纤维化（+），病变范围占全肺的20%50%，肺泡结构紊乱；3级：重度肺间质纤维化（+），病变范围大于50%，肺泡融合，肺实质结构紊乱。1.6  HYP含量测定  余右肺，称重后剪碎，每克肺组织加无菌生理盐水4ml研磨，以3000r/min离心10min，过滤，得上清液，采用酸水解法测定41.7  统计方法  计量资料以x±s表示，应用SPSS13.0统计软件分析，多组间均数比较采用方差分析，计数资料采用卡方分析。2  结果2.1  肺组织形态学改变2.1.1  肺组织整体外观观察  正常对照组肺

9、外观无明显异常，呈粉红色，表面光滑；模型组7d时，双肺有散在灶状出血点，28d时部分肺叶呈暗红色，部分肺叶呈灰白色，有大小不等的白色小结节，部分体积缩小，硬度增加。中药高剂量组第7d时，肉眼观察肺表面出血点较模型组明显少，28d时肉眼观察肺脏表面较模型组光滑，瘢痕及陈旧出血点明显减少；低剂量组和强的松组7d时，肺脏外观与中药高剂量组相近，但28d时，部分肺叶呈暗红色，有少量大小不等的白色小结节。2.1.2  肺组织切片光镜观察  正常对照组肺泡壁结构完整，肺泡腔内无分泌物，无炎性细胞浸润，肺泡间隔无无增宽，无肺萎陷及血管壁增厚；模型组7d时可见肺泡腔内渗出物增多，肺泡腔及肺

10、间质有大量炎性细胞浸润。可见少量成纤维细胞，局部肺萎陷；28d时，肺泡炎减轻，肺泡壁显著增厚，一部分肺泡腔消失，由胶原纤维、成纤维细胞占据，肺间质和胸膜层胶原纤维显著增多；中药高剂量组7d时肺间质炎性细胞渗出和炎性细胞浸润较模型组少，肺组织结构较模型组完整，28d时肺泡间隔增厚及间质内成纤维细胞增殖较模型组减轻，低剂量组和强的松组7d时肺脏组织学病理与高剂量组相近，28 d时肺泡间隔增厚及间质内成纤维增殖亦较模型组减轻，各治疗组间无明显差别。各组大鼠肺泡炎和肺纤维化分级，经卡方分析可得同一时间段的不同组别肺泡炎和肺纤维化程度的差异具有统计学意义(P<0.01)。2.1.3  肺组织切片电镜观察  正常对照组肺组织结构未见异常，肺泡腔开放，肺泡壁由型上皮细胞衬复，其间可见少量型肺泡上皮，两型上皮细胞结构完整。模型组7d时可见型细胞受损，上皮基底膜水肿、裸露，甚至断裂