携带人脂联素基因重组腺病毒的构建及表达

1、携带人脂联素基因重组腺病毒的构建及表达 10-11-15 15:34:00 编辑：studa20 作者：陈闽 何姜 刘小莺 黄敬泽 王林曦 刘礼斌【摘要】 目的 构建携带人脂联素基因的重组腺病毒载体，为进一步研究脂联素的功能提供实验基础。 方法 以带有人脂联素基因的质粒pINCYAPM1为模板，聚合酶链反应扩增人脂联素基因APM1，并将其定向克隆于真核表达载体pDC315EGFP，与辅助质粒pBHGloxE1，3Cre共转染HEK293细胞，经位点特异重组包装得到重组腺病毒AdAPM1。通过Realtime PCR和Western blot分别检测重组腺病毒AdAPM1感染HEK293细胞后的

2、表达。 结果 重组腺病毒AdAPM1包装成功，病毒滴度6.31012pfu/mL。Realtime PCR和Western blot检测证实APM1在HEK293中表达。 结论 应用细胞内同源重组方法成功构建了携带人脂联素基因的重组腺病毒。 【关键词】 胞间信号肽类和蛋白质类 基因 转染 腺病毒科脂联素亦称Acrp30(30 KDa脂肪补体相关蛋白)、GBP28(28 KDa凝胶结合蛋白)、APM1(脂肪组织最丰富的基因转录产物)等，是由Scherer等人于1995年从诱导分化的鼠脂肪细胞中最早发现的具有244个氨基酸的多肽1。由于其具有改善胰岛素抵抗、促进血浆游离脂肪酸氧化、抗动脉粥样硬化等

3、作用而成为近年研究的热点24。本研究旨在体外构建人脂联素基因腺病毒载体及检测其表达，为进一步研究脂联素的功能及调控机制提供实验基础。1 材料和方法1.1 主要试剂及仪器 内切酶EcoRI、SalI(美国NEB公司)，T4 DNA ligase(美国NEB公司)，Taq polymerase(日本Takara生物公司)，dNTP(美国Promega公司)，Plasmid抽提 Kit(德国QIAGEN公司)，DMEM培养基(美国Gibco公司)，Lipofectamine 2000(美国Invitrogen公司)，携带人脂联素基因的质粒pINCYAPM1(美国OpenBiosystems生物公司)

4、，Mouse antiFlag抗体(美国Sigma公司)HEK293细胞(美国ATCC公司)，真核表达载体pDC315EGFP(上海吉凯生物公司)，辅助包装质粒pBHGlox E1，3 Cre(加拿大Microbix公司)，PCR仪(美国Applied Biosystems公司)，Real time PCR仪 (美国BioRad公司)，CO2培养箱(日本SANYO公司)，电泳仪(美国BioRad公司)。引物(中国吉凯公司合成)。1.2 方法1.2.1 腺病毒穿梭质粒pDC315APM1的构建及鉴定 以带有人脂联素基因的质粒pINCYAPM1为模板，聚合酶链反应克隆人脂联素基因APM1，随后以E

5、coRI、SalI双酶切聚合酶链反应扩增产物及真核表达载体pDC315EGFP，纯化酶切产物后进行定向连接，转化大肠杆菌感受态细胞，铺板，将长出的克隆通过PCR和测序鉴定。人脂联素cDNA片段引物(778 bp，用于PCR获取目的基因，有下划线的24个碱基序列代表flag tag序列，PCR产物片段长)：上游：5CCGGAATTCATGCTGTTGCTGGGAGCTG3下游：5ACGCGTCGACTCACTTGTCATCGTCATCCTTGTAGTCGTTGGTGTCATGGTAGAGAAG3用于PCR鉴定目的基因定向连接的阳性克隆菌落的引物(477 bp，上游引物的设计位于基因内部，下游引物

6、设计位于载体)：上游：5GTAAAGCGAATGGGCATG3下游：5ACGTGGGTATAAGAGGCG31.2.2 重组腺病毒AdAPM1的包装 HEK293细胞转染前1天传代，使得转染时细胞汇合率为50%60%，采用脂质体法将腺病毒穿梭质粒pDC315APM1和辅助质粒pBHGloxE1，3Cre双质粒共转染HEK293细胞，待大部分细胞出现细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)后低速离心收集细胞，并重悬于2 mL PBS中，-70 /37 反复冻融，振荡3次，;离心收集上清，此成为病毒原液，-80 保存。1.2.3 重组腺病毒的扩增、纯化及滴度测定 取上述病毒原液重

7、新感染HEK293细胞，待大部分细胞CPE完全形成后，收集细胞，PBS重悬，冻融细胞，离心收集上清，-80 保存。按AdenXTMvirus Purification Kit(BD Biosciences，Clontech)的步骤纯化重组腺病毒。采用终点稀释法对腺病毒滴度进行测定，公式：病毒滴度=10(x+0. 8)(pfu/mL)1.2.4 重组腺病毒的鉴定1.2.4.1 腺病毒感染检测 取包装过程中的转染后第12天的细胞培养上清液，10 000 r/min离心1 min，吸出上清液加入到6 cm dish 中的Hek293细胞中，观察细胞生长情况。1.2.4.2 重组腺病毒感染HEK293

8、后脂联素mRNA表达的检测 感染前1天将生长良好的HEK293细胞按5104mL-1接种于24孔板中，用感染复数(multiply of infection，MOI)为50的腺病毒感染细胞，感染时间达到2 d后收集细胞，抽提RNA进行Realtime PCR检测实验。用于Realtime PCR检测实验的引物，扩增片段(192 bp)：上游：5TTGCCTACCACATCACAGTC3下游：5GTCCATTACGCTCTCCTTCC31.2.4.3 重组腺病毒感染HEK293后脂联素蛋白表达的检测 通过检测FLAG 表达，间接检测脂联素蛋白的表达。腺病毒感染HEK293细胞后2 d，收集细胞，制备蛋白样品，10%SD