发酵大题范围

1、参数检测例：鸟苷生产例：鸟苷生产在鸟苷发酵中，发在鸟苷发酵中，发现发酵到现发酵到40小时后小时后鸟苷合成速率下降，鸟苷合成速率下降，但糖耗速率并未下但糖耗速率并未下降，而且由于耗糖降，而且由于耗糖,使发酵过程使发酵过程pH下降，下降，补入氨水增多。那补入氨水增多。那么糖耗到哪里去了么糖耗到哪里去了呢？呢？于是进行以下一些于是进行以下一些测定与分析测定与分析什么因素导致什么因素导致pH下降？下降？1 1、有机酸的积累、有机酸的积累 有机酸积累有机酸积累 pH下降下降 补加补加氨水氨水 在正常代谢情况下，细胞通过在正常代谢情况下，细胞通过EMP途径和途径和TCA循环的过程是为细胞合成提供前体和能循

2、环的过程是为细胞合成提供前体和能量的，按照细胞经济学的原则不会供过于求，量的，按照细胞经济学的原则不会供过于求，即不会出现有机酸的积累即不会出现有机酸的积累若发酵后期有机酸积累会引起加入的若发酵后期有机酸积累会引起加入的NH4+积累，相应出现产苷速率下降。积累，相应出现产苷速率下降。代谢不代谢不正常正常测定以下中间物测定以下中间物发酵后期丙酮酸积累发酵后期丙酮酸积累2 2、氨基酸的积累、氨基酸的积累在有机酸分析的基础上进一步通过在有机酸分析的基础上进一步通过HPLC测定发酵过程中不同时间发酵液中氨基酸，测定发酵过程中不同时间发酵液中氨基酸，结果发现总氨基酸积累并且其积累晚于有结果发现总氨基酸积

3、累并且其积累晚于有机酸和机酸和NH4+积累。积累。氨基酸成分分析表明，初始发酵液中谷氨氨基酸成分分析表明，初始发酵液中谷氨酸浓度比较高，其它氨基酸浓度都较低，酸浓度比较高，其它氨基酸浓度都较低，随着发酵过程的进行谷氨酸很快被用于菌随着发酵过程的进行谷氨酸很快被用于菌体合成，在体合成，在8小时之前已经降到很低水平，小时之前已经降到很低水平，并始终维持在低水平，而在并始终维持在低水平，而在48小时左右丙小时左右丙氨酸开始出现明显的积累，发酵液中积累氨酸开始出现明显的积累，发酵液中积累量达到初始量的量达到初始量的12.6倍之多，其它十余种倍之多，其它十余种氨基酸浓度则变化不大，并且在整个发酵氨基酸浓

4、度则变化不大，并且在整个发酵过程中都维持在较低水平。因此，丙氨酸过程中都维持在较低水平。因此，丙氨酸浓度变化可能是导致代谢流迁移所致。浓度变化可能是导致代谢流迁移所致。3 3、分析原因、分析原因发酵过程中积累的氨基酸主要是丙氨酸，发酵过程中积累的氨基酸主要是丙氨酸，而丙氨酸的合成可以直接由丙酮酸转化而而丙氨酸的合成可以直接由丙酮酸转化而来，因此可以推断由于来，因此可以推断由于EMP途径代谢流的途径代谢流的增加造成了丙酮酸的积累，丙酮酸随后转增加造成了丙酮酸的积累，丙酮酸随后转化为丙氨酸化为丙氨酸丙氨酸本身又会对谷氨酸合成酶（丙氨酸本身又会对谷氨酸合成酶（GS）造成反馈抑制和阻遏，使产苷速率降低

5、。造成反馈抑制和阻遏，使产苷速率降低。恶性循环恶性循环激活磷酸果糖激酶激活磷酸果糖激酶丙酮酸积累丙酮酸积累 氨水补加增加氨水补加增加NH4+积累积累抑制抑制GS抑制抑制TCA循环循环丙酮酸积累丙酮酸积累EMP流量增加流量增加丙氨酸丙氨酸积累积累（二）（二） 代谢流迁移的酶学证明代谢流迁移的酶学证明糖代谢途径关键酶糖代谢途径关键酶糖酵解途径（糖酵解途径（EMP）在糖酵解途径中有两个不可逆的步骤的酶：在糖酵解途径中有两个不可逆的步骤的酶：磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶 磷酸果糖激酶的时序分析磷酸果糖激酶的时序分析12小时时由于生长处于对数生长初期，代谢活力较低，小时时由于生长处于

6、对数生长初期，代谢活力较低，所以所以PFK的活力相对较低。的活力相对较低。24小时后随着发酵过程进小时后随着发酵过程进入平稳产物形成期和细胞生长期，磷酸果糖激酶的活入平稳产物形成期和细胞生长期，磷酸果糖激酶的活力也基本保持平稳。但是到力也基本保持平稳。但是到40小时以后，鸟苷形成速小时以后，鸟苷形成速率减慢甚至停止，同时观察到氨基酸和有机酸积累，率减慢甚至停止，同时观察到氨基酸和有机酸积累，PFK相对酶活增加，这表明此时通过相对酶活增加，这表明此时通过EMP途径的糖代途径的糖代谢通量已有了明显的增加。谢通量已有了明显的增加。 丙酮酸激酶时序分析丙酮酸激酶时序分析丙酮酸激酶没有表现出明显的酶活增

7、加，丙酮酸激酶没有表现出明显的酶活增加，而是在而是在24小时就基本上达到其最大值，随小时就基本上达到其最大值，随后维持在恒定的水平，这表明在糖代谢时后维持在恒定的水平，这表明在糖代谢时EMP途径代谢流增加中丙酮酸激酶所起的途径代谢流增加中丙酮酸激酶所起的作用不大，不是造成代谢流迁移的主要因作用不大，不是造成代谢流迁移的主要因素素 磷酸戊糖途径（磷酸戊糖途径（HMP）关键酶）关键酶磷酸戊糖途径中主要的限速酶是磷酸戊糖途径中主要的限速酶是6磷酸葡磷酸葡萄糖脱氢酶，该酶催化萄糖脱氢酶，该酶催化6磷酸葡萄糖脱氢磷酸葡萄糖脱氢生成生成6磷酸葡萄糖酸内酯磷酸葡萄糖酸内酯。6磷酸葡萄糖脱氢酶时序分析磷酸葡萄

8、糖脱氢酶时序分析由图可以看到，早期由图可以看到，早期6磷酸葡萄糖脱氢酶活力很高，磷酸葡萄糖脱氢酶活力很高，这可能是前期菌体合成代谢比较活跃，通过这可能是前期菌体合成代谢比较活跃，通过HMP途径途径合成用于细胞成分的核酸等组成物质；随后基本不变，合成用于细胞成分的核酸等组成物质；随后基本不变，从而保持从而保持EMP和和HMP途径通量的平衡，此时稳定持续途径通量的平衡，此时稳定持续的形成产物；但是到的形成产物；但是到40小时后，小时后，6磷酸葡萄糖脱氢磷酸葡萄糖脱氢酶已经表现出明显的下降趋势，并且随着后期发酵过酶已经表现出明显的下降趋势，并且随着后期发酵过程的进行而持续下降。根据物料平衡原则，有可

9、能糖程的进行而持续下降。根据物料平衡原则，有可能糖代谢在代谢在HMP途径通量下降而途径通量下降而EMP途径通量增加。途径通量增加。三羧酸三羧酸(TCA)循环的关键酶循环的关键酶三羧酸循环是三羧酸循环是“消耗消耗”丙酮酸的途径，丙酮酸的途径，三羧酸流量大丙酮酸不会积累。三羧三羧酸流量大丙酮酸不会积累。三羧酸循环中的关键酶为酸循环中的关键酶为柠檬酸合成酶柠檬酸合成酶，其催化乙酰辅酶其催化乙酰辅酶A与草酰乙酸缩合形与草酰乙酸缩合形成柠檬酸，是三羧酸循环的启动步骤，成柠檬酸，是三羧酸循环的启动步骤，也是三羧酸循环中的主要控制点，由也是三羧酸循环中的主要控制点，由柠檬酸合成酶所催化的反应是三羧酸柠檬酸合

10、成酶所催化的反应是三羧酸循环中的第一个限速步骤。循环中的第一个限速步骤。柠檬酸合成酶时序分析柠檬酸合成酶时序分析从图可以看到，从图可以看到，TCA循环的关键酶柠檬循环的关键酶柠檬酸合成酶在整个发酵过程中，尤其是在酸合成酶在整个发酵过程中，尤其是在后期产苷速率下降的过程中都维持比较后期产苷速率下降的过程中都维持比较平稳的水平，这表明在发酵过程后期所平稳的水平，这表明在发酵过程后期所发生的代谢流迁移时，发生的代谢流迁移时，TCA循环的通量循环的通量并没有发生明显的增加。即并没有发生明显的增加。即代谢流迁移代谢流迁移发生在发生在EMP和和HMP之间，主要是由于之间，主要是由于EMP和和HMP途径之间

11、的分配平衡被打破途径之间的分配平衡被打破所造成的。所造成的。EMP途径代谢流的增加造成途径代谢流的增加造成了一种代谢流的溢流现象。了一种代谢流的溢流现象。丙氨酸脱氢酶的时序分析丙氨酸脱氢酶的时序分析在发酵中后期，丙氨酸脱氢酶活力出现了明在发酵中后期，丙氨酸脱氢酶活力出现了明显的增加。丙氨酸脱氢酶催化由丙酮酸生成显的增加。丙氨酸脱氢酶催化由丙酮酸生成丙氨酸，该酶活性增加与丙酮酸和丙氨酸的丙氨酸，该酶活性增加与丙酮酸和丙氨酸的时序增加相吻合，这些数据表明代谢流的溢时序增加相吻合，这些数据表明代谢流的溢流现象发生在柠檬酸合成酶之前的丙酮酸节流现象发生在柠檬酸合成酶之前的丙酮酸节点，通过丙氨酸脱氢酶生

12、成丙氨酸，从而缓点，通过丙氨酸脱氢酶生成丙氨酸，从而缓解了解了EMP途径代谢流增加造成的代谢不平衡。途径代谢流增加造成的代谢不平衡。结果加入结果加入EMP途径的抑制剂，克服了途径的抑制剂，克服了代谢流迁移的问题，提高了鸟苷的产代谢流迁移的问题，提高了鸟苷的产量量基因工程菌（三）基因不稳定性（三）基因不稳定性生产的目标是得到最大量的外源蛋白，但生产的目标是得到最大量的外源蛋白，但是大量外源蛋白的形成对宿主细胞是有损是大量外源蛋白的形成对宿主细胞是有损害的，通常是致死的，失去制造外源蛋白害的，通常是致死的，失去制造外源蛋白的能力的细胞一般生长得快得多，从而能的能力的细胞一般生长得快得多，从而能替代

13、有生产能力的菌株，这就导致基因的替代有生产能力的菌株，这就导致基因的不稳定性。不稳定性。基因的不稳定性原因：基因的不稳定性原因：l分离丢失分离丢失l结构不稳定性结构不稳定性l宿主细胞调节突变宿主细胞调节突变 1 1、分离丢失、分离丢失 指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。菌的现象。为什么会出现质粒丢失呢？为什么会出现质粒丢失呢？质粒可分为高拷贝质粒（质粒可分为高拷贝质粒（20拷贝拷贝/细胞）和细胞）和低拷贝质粒（有时低到每个细胞一至二个拷低拷贝质粒（有时低到每个细胞一至二个拷贝）。低拷贝质粒有专门的机制保证在子代贝）。低拷贝质粒有专门的机制保证

14、在子代细胞中有相等的分配，高拷贝质粒通常很少细胞中有相等的分配，高拷贝质粒通常很少遵循二分法分配到子代细胞。对于高拷贝质遵循二分法分配到子代细胞。对于高拷贝质粒，绝大多数子细胞接受一些质粒，也有可粒，绝大多数子细胞接受一些质粒，也有可能有的细胞没有接受质粒，出现质粒丢失。能有的细胞没有接受质粒，出现质粒丢失。虽然形成无质粒细胞的可能性是低的（每百虽然形成无质粒细胞的可能性是低的（每百万细胞分裂中一个）。万细胞分裂中一个）。在大的反应器中含有非常多的细胞，总会在大的反应器中含有非常多的细胞，总会存在无质粒细胞，例如存在无质粒细胞，例如1000L发酵液，每发酵液，每毫升有毫升有109个细胞，总共就

15、有个细胞，总共就有1015个细胞，个细胞，那么在这个反应器中就含有那么在这个反应器中就含有109个无质粒个无质粒细胞。细胞。质粒的分离丢失受许多环境因素影响，如质粒的分离丢失受许多环境因素影响，如溶氧、温度、培养基组成和恒化器中的稀溶氧、温度、培养基组成和恒化器中的稀释速率。释速率。许多质粒也会形成多聚体，它是相同质粒许多质粒也会形成多聚体，它是相同质粒附着在一起形成一个单位。附着在一起形成一个单位。分离丢失示意图分离丢失示意图2 2、质粒结构不稳定性、质粒结构不稳定性 指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。失所致工程菌性能的改变。如果

16、质粒发生如果质粒发生突变，仍保留了抗生素抗性基因，但不合突变，仍保留了抗生素抗性基因，但不合成外源蛋白，那么这些突变株仍能在含有成外源蛋白，那么这些突变株仍能在含有抗生素的培养基中生长。而且由于不合成抗生素的培养基中生长。而且由于不合成外源蛋白，生长得比原来的工程菌更快，外源蛋白，生长得比原来的工程菌更快，使得在这种培养物中带有突变质粒的菌占使得在这种培养物中带有突变质粒的菌占统治地位，这种培养情况就是结构不稳定统治地位，这种培养情况就是结构不稳定性。性。3 3、宿主细胞突变、宿主细胞突变 宿主细胞的突变也会造成生产能力的下降。宿主细胞的突变也会造成生产能力的下降。这些突变通常这些突变通常改变

17、细胞调节改变细胞调节，结果减少目标，结果减少目标蛋白的合成。例如，控制外源蛋白表达的启蛋白的合成。例如，控制外源蛋白表达的启动子，利用宿主细胞的启动子，如果宿主细动子，利用宿主细胞的启动子，如果宿主细胞启动子的改变，将大大改变质粒编码蛋白胞启动子的改变，将大大改变质粒编码蛋白的生产水平。乳糖操纵子是常用是操纵子，的生产水平。乳糖操纵子是常用是操纵子，通过加入乳糖或它的结构类似物（如通过加入乳糖或它的结构类似物（如IPTG）来启动表达，如果乳糖操纵子编码半乳糖苷来启动表达，如果乳糖操纵子编码半乳糖苷透酶的基因发生突变就会阻止乳糖或乳糖的透酶的基因发生突变就会阻止乳糖或乳糖的结构类似物进入细胞，从

18、而不能启动细胞的结构类似物进入细胞，从而不能启动细胞的表达。表达。4 4、生长速率占优势的不稳定性、生长速率占优势的不稳定性所有这三种因素的关键是变异了的宿主载体所有这三种因素的关键是变异了的宿主载体系统和原宿主系统和原宿主-载体系统的生长速率不同。如载体系统的生长速率不同。如果变异了的宿主载体系统比原来的宿主果变异了的宿主载体系统比原来的宿主-载体载体系统有生长优势，那么变异了的系统将最终系统有生长优势，那么变异了的系统将最终占优势，基因不稳定性就出现。占优势，基因不稳定性就出现。 （四）表达的诱导（四）表达的诱导基因工程菌的产物表达需要诱导，诱因主要基因工程菌的产物表达需要诱导，诱因主要有

19、：温度诱导、乳糖或乳糖结构类似物诱导、有：温度诱导、乳糖或乳糖结构类似物诱导、氧饥饿诱导、葡萄糖饥饿诱导、甲醇诱导等。氧饥饿诱导、葡萄糖饥饿诱导、甲醇诱导等。提高质粒稳定性的方法提高质粒稳定性的方法 1、两阶段培养法：第一阶段使菌体生长至一定密度，、两阶段培养法：第一阶段使菌体生长至一定密度，第二阶段诱导外源基因的表达。在培养基中加入选择性压第二阶段诱导外源基因的表达。在培养基中加入选择性压力如抗生素等，以抑制质粒丢力如抗生素等，以抑制质粒丢 失菌的生长。失菌的生长。 2、通过控制环境参数（温度、通过控制环境参数（温度、PH、培养基组分和溶、培养基组分和溶解氧浓度），调节比解氧浓度），调节比

20、生长速率，使工程菌生长具有优势。生长速率，使工程菌生长具有优势。有些含质粒的菌对发酵环境的改变有些含质粒的菌对发酵环境的改变 比不含质粒的菌反应慢，比不含质粒的菌反应慢，因而间歇改变培养条件以改变这两种菌的比因而间歇改变培养条件以改变这两种菌的比 生长速率，可生长速率，可以改善质粒的稳定性。以改善质粒的稳定性。染菌3 3、不同时间染菌对发酵的影响、不同时间染菌对发酵的影响污染时间是指用无菌检测方法确准的污染污染时间是指用无菌检测方法确准的污染时间，不是杂菌窜入培养液的时间。时间，不是杂菌窜入培养液的时间。杂菌进入培养液后，需有足够的生长、繁杂菌进入培养液后，需有足够的生长、繁殖的时间才能显现出

21、来，显现的时间又与殖的时间才能显现出来，显现的时间又与污染菌量有关。污染的菌量多，显现染菌污染菌量有关。污染的菌量多，显现染菌所需的时间就短，污染菌量少，显现染菌所需的时间就短，污染菌量少，显现染菌的时间就长。的时间就长。（1）种子培养期染菌）种子培养期染菌由于接种量较小，生产菌生长一开始不由于接种量较小，生产菌生长一开始不占优势，而且培养液中几乎没有抗生素占优势，而且培养液中几乎没有抗生素（产物）或只有很少抗生素（产物）。（产物）或只有很少抗生素（产物）。因而它防御杂菌能力低，容易污染杂菌。因而它防御杂菌能力低，容易污染杂菌。如在此阶段染菌，应将培养液全部废弃。如在此阶段染菌，应将培养液全部

22、废弃。（2）发酵前期染菌）发酵前期染菌发酵前期最易染菌，且危害最大。发酵前期最易染菌，且危害最大。原因原因 发酵前期菌量不很多，发酵前期菌量不很多，与杂菌没有竞与杂菌没有竞争优势；争优势；且还未合成产物（抗生素）或产生且还未合成产物（抗生素）或产生很少，很少，抵御杂菌能力弱。抵御杂菌能力弱。在这个时期要特别警惕以制止染菌的发生。在这个时期要特别警惕以制止染菌的发生。染菌措施染菌措施 可以用降低培养温度，调整补料可以用降低培养温度，调整补料量，用酸碱调量，用酸碱调pH值，缩短培养周期等措施予值，缩短培养周期等措施予以补救。如果前期染菌，且培养基养料消耗以补救。如果前期染菌，且培养基养料消耗不多，

23、可以重新灭菌，补加一些营养，重新不多，可以重新灭菌，补加一些营养，重新接种再用。接种再用。（3）发酵中期染菌）发酵中期染菌 发酵中期染菌会严重干扰产生菌的代谢。杂菌大发酵中期染菌会严重干扰产生菌的代谢。杂菌大量产酸，培养液量产酸，培养液pH下降；糖、氮消耗快，发酵下降；糖、氮消耗快，发酵液发粘，菌丝自溶，产物分泌减少或停止，有时液发粘，菌丝自溶，产物分泌减少或停止，有时甚至会使已产生的产物分解。有时也会使发酵液甚至会使已产生的产物分解。有时也会使发酵液发臭，产生大量泡沫。发臭，产生大量泡沫。措施措施 降温培养，减少补料，密切注意代谢变降温培养，减少补料，密切注意代谢变化情况。如果发酵单位到达一

24、定水平可以提前放化情况。如果发酵单位到达一定水平可以提前放罐，或者抗生素生产中可以将高单位的发酵液输罐，或者抗生素生产中可以将高单位的发酵液输送一部分到染菌罐，抑制杂菌。送一部分到染菌罐，抑制杂菌。（4）发酵后期染菌）发酵后期染菌发酵后期发酵液内已积累大量的产发酵后期发酵液内已积累大量的产物，特别是抗生素，对杂菌有一定物，特别是抗生素，对杂菌有一定的抑制或杀灭能力。因此如果染菌的抑制或杀灭能力。因此如果染菌不多，对生产影响不大。如果染菌不多，对生产影响不大。如果染菌严重，又破坏性较大，可以提前放严重，又破坏性较大，可以提前放罐。罐。带图题谷氨酸正常发酵与异常发酵溶解氧变化谷氨酸正常发酵与异常发

25、酵溶解氧变化氧气实例一对黄色短杆菌生物合成氨基酸时发现：菌体的临界溶氧浓度为0.01mg/L当溶氧浓度低于当溶氧浓度低于1.0时，谷氨酸和天冬氨酸族时，谷氨酸和天冬氨酸族氨基酸合成受到影响，但苯丙氨酸，缬氨酸氨基酸合成受到影响，但苯丙氨酸，缬氨酸和亮氨酸最佳合成的溶氧浓度分别为和亮氨酸最佳合成的溶氧浓度分别为0.55、0.60和和0.85。从合成途径中可知，谷氨酸和天冬氨酸族的氨基酸来自于三羧酸循环(TCA)的中间体，而苯丙氨酸、缬氨酸和亮氨酸来自于糖酵解的中间体，即来自于丙酮酸和磷酸稀醇式丙酮酸。温度在四环素发酵中，还发现生物热和菌的呼吸强度的变化有在四环素发酵中，还发现生物热和菌的呼吸强度

26、的变化有对应关系，特别是在对应关系，特别是在8080小时以前。从此实验中还可看到，小时以前。从此实验中还可看到，当产生的生物热达到高峰时，糖的利用速度也最大。另外当产生的生物热达到高峰时，糖的利用速度也最大。另外也有人提出，可从菌体的耗氧率来衡量生物热的大小。也有人提出，可从菌体的耗氧率来衡量生物热的大小。 四环素生物合成过程中系列参数的动态变化四环素生物合成过程中系列参数的动态变化过程过程1 1：效价；：效价；2 2：呼吸强度；：呼吸强度；3 3：生物热；：生物热；4 4：糖：糖浓度浓度第二题1 1、微生物对温度的要求不同与它们的膜、微生物对温度的要求不同与它们的膜结构物理化学性质有密切关系

27、结构物理化学性质有密切关系根据细胞膜的液体镶嵌模型，细胞在正常根据细胞膜的液体镶嵌模型，细胞在正常生理条件下，膜中的脂质成分应保持生理条件下，膜中的脂质成分应保持液晶液晶状态状态，只有当细胞膜处于液晶状态，才能只有当细胞膜处于液晶状态，才能维持细胞的正常生理功能，使细胞处于最维持细胞的正常生理功能，使细胞处于最佳生长状态佳生长状态微生物的生长温度与细胞膜的液晶温度范微生物的生长温度与细胞膜的液晶温度范围相一致。围相一致。二、微生物与温度相关性的原理二、微生物与温度相关性的原理2 2、蛋白质结构、蛋白质结构人们采用二种方案来研究酶在低温条件人们采用二种方案来研究酶在低温条件下的结构完整性和催化功能：下的结构完整性和催化功能：(1)(1)通过自通过自然或诱导